人牙本质涎磷蛋白成熟肽cdna的克隆、序列分析和原核表达论文

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1、人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达论文.freelandentinsailophosphoprotein;geneclone;prokaryoticexpressionAbstract:AIMToclone，sequenceandprokaryoticexpresshumandentinsailophosphoprotein（DSPP）.METHODSInthestudy，totalRNAthetoothgermsofalegallyabortedembryobyacidguanidiniumthiocyan

2、ata-phenol-choroformmethod，thedesiredDNAproductthetotalRNAbyRT-PCRersin-cludingOligo（dt）andters.Theseg-ment（about600bp）idedintoE.colihoststrainXL1-Blue.ThedoublestrandedDNAofthepositivecloneappingandDNAsequencing.DSPPapandsequenceofhumanDSPPencodingmatureproteinanDSPP

3、cDNAencodingmatureproteincouldbeobtainedandthushavelaidafoundationforfuturefunctionresearches.0引言牙本质涎磷蛋白（dentinsailophosphoprotein，DSPP）是近年发现的牙本质特异蛋白，其确切功能尚不清楚，可能参与了成牙本质细胞的分化和矿化.目前普遍认为DSPP是成牙本质细胞分化的唯一客观指标，而且DSPP是牙本质发育不全（dentinogenesisimperfecta，DGI）Ⅱ型的重要候选基因［1］.为了深入研究

4、DSPP的生物学功能，分析和探讨成牙本质细胞分化及牙本质形成机制，从基因水平揭示人类牙本质发育不全Ⅱ型的发病机制，用基因工程的方法表达有活性的DSPP蛋白，本实验利用人牙胚组织，根据报道的人DSPPcDNA基因序列设计PCR引物，采用逆转录PCR方法，克隆到DSPP成熟区基因片段，对其进行核苷酸序列分析，并在原核细胞中进行表达.1材料和方法1.1材料人牙胚的来源和获取:本实验所用人牙胚来源于合法引产人胚胎.无菌条件下暴露牙龈部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙、乳磨牙，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存.总RNA的提取:磨碎冻

5、存的人牙胚组织，在盛有预冷的变性缓冲液（德国宝灵曼公司）的匀浆器中充分破碎组织细胞，组织与缓冲液的比例为110.用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA，并进行电泳鉴定.1.2方法1.2.1cDNA的合成和PCR扩增根据报道的人DSPP的cDNA序列，采用PCGene设计PCR扩增的两条引物:5’端引物为GGTGTCCTGGTG-CATGAAGGT，3’端引物为CTTCGTCTTCATC-CTCATCTG，由中国科学院上海细胞生物学研究所基因工程组合成.用Gibco公司的SuperScriptTM试剂盒，按其说明进行逆转录（RT

6、）合成cDNA第一链，以其为模板，PCR扩增出人DSPP成熟区基因片段（美国MJResearch公司PTC-150型PCR仪）.TaqPlusⅡDNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司.1.2.2PCR产物的克隆和酶谱分析PCR产物用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenoega公司）补平，将载体pBluescriptKS（pBS）用EcoRⅠ酶切，然后用10gL-1琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切取目的片段和载体，用柱式胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）回收PCR目的片段和载体pBS，T4DNA连接酶16℃连接过夜，制备大肠杆

7、菌XL1-Blue感受态细胞，转化连接产物，蓝白斑筛选阳性克隆pBS-hDSPP.碱裂解法快速提取pBS-hDSPP质粒DNA，用EcoRⅠ单酶切和SalⅠ加PstⅠ双酶切鉴定目的基因是否插入质粒载体中.1.2.3核苷酸序列分析将酶切鉴定正确的pBS-hDSPP重组质粒再转化XL1-Blue感受态细胞，培养扩增，用T3，T7作引物，利用计算机自动测序仪进行核苷酸序列分析.1.2.4表达载体构建及蛋白质表达从pBS-hD-SPP重组载体中用BamHI和XholI双酶切切出hD-SPP基因，重组入表达载体pGEX-3X中，构建重组表达

8、载体.重组载体经酶切鉴定证实构建成功.将鉴定正确的重组表达载体和pGEX-3X空载体分别转化大肠杆菌BL21，DH5а，JM109，XL1-Blue等，琼脂糖固体培养板培养16h，挑选菌落接种于含氨苄的LB培养基中培养16h，按1%比例分别转种3m