人胆固醇酯转运蛋白的cdna克隆、 原核表达及抗

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1、人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆、原核表达及抗【摘要】目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP）cDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法:采用RTPCR方法,将人CETP基因克隆到pET30b(+)上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、:Toclonehumancholesterylestertransferprotein(CETP)cDNA,expressandpurifyhumanCETPinE.coliandprepareCETPs

2、pecificrabbitantiserum.METHODS:byRTPCRmethod,theencodingsequenceofhumancholesterylestertransferprotein(CETP)edSDSpolyacrylamidegel,andtheantiserumagainstCETPmunofluorescenceassay.RESULTS:TheresultsofSDSPAGEshoofinclusionbodiesinBL21(DE3)andthebestexpressiontimepreparedSDSPAGEreac

3、tedspecificallyagainstCETPanCETP.　　[Key　　[摘要]目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP）cDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法:采用RTPCR方法,将人CETP基因克隆到pET30b(+)上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Westernblot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果:SDSPAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效

4、表达,最佳诱导表达时间为4h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105。Westernblot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。　　[关键词]胆固醇酯转运蛋白;原核表达;抗血清人胆固醇转运蛋白（cholesterylestertransferprotein,CETP）是一个极度疏水的糖蛋白,包含476个氨基酸,非极性氨基酸占45%[1]。在逆向胆固醇转运中,C

5、ETP促进胆固醇酯从高密度脂蛋白（HDL）转运到含载脂蛋白B（apoB）的脂蛋白颗粒中,同时反向转运甘油三脂,因参与了血浆脂蛋白胆固醇水平的调控和脂蛋白颗粒的重塑,CETP在脂蛋白代谢中的作用近年来倍受重视[2]。然而,到目前为止,尽管人们已经获得了几种CETP的抑制剂[3],但对CETP究竟是抗动脉粥样硬化(AS)因子还是致AS因子一直存在争议。在逆向胆固醇转运中,HDL颗粒内的胆固醇酯被CETP转运到含apoB的脂蛋白中,随后,这些脂蛋白被肝吸收分解,由于促进了外周组织多余胆固醇向肝的运送,避免了胆固醇在血管内的富集,CETP被认为是抗动脉粥样硬化的。然而,

6、另一方面,这个过程直接导致了具有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平的下降,因此,CETP又被认为是促动脉粥样硬化的。大量的流行病学及动物研究显示,CETP抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化特性之间可能存在内在平衡,其确切功能依赖于代谢环境和遗传背景[1]。我们在已发表的人CETPcDNA序列基础上,通过RTPCR方法扩增得到CETP成熟蛋白编码序列并克隆到原核表达载体中,化学诱导重组蛋白的高效表达,并制备出相应的特异性抗血清,为深入研究CETP在AS中的确切功能以及CETP蛋白水平的检测等奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　人肝组织

7、来自北京协和医院外科肝部分切除的手术标本。新西兰大耳白兔(雄性,体质量2.5～3.0kg)购自中国药品生物制品检定所。pET30b(+)质粒载体购自Novagen公司。BL21(DE3)菌株为本室冻存。限制性内切酶及pyrobestDNA聚合酶等工具酶购自TaKaRa公司。　　SuperScriptFirstStrandSynthesisSystemforRTPCR及pcDNA3.1/mycHis(-)A质粒购自Invitrogen公司。弗氏完全佐剂、不完全佐剂和DMEM培养基购自Gibco公司。蛋白标准购自Fermentas公司。COS7细胞购自中国医

8、学科学院基础医学研究所细