他克莫斯对树突状细胞分化、成熟和功能的影响论文

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1、他克莫斯对树突状细胞分化、成熟和功能的影响论文郑凯谭建明吴卫真杨顺良徐廷昭【摘要】目的：探讨他克莫斯（tacrolimus,FK506）对大鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)分化、成熟和免疫学活性的影响.方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同浓度的FK506进行培养，采用流式细胞术行DCs表型分析，ELISA法检测培养上清中IL12的水平并行体外混合淋巴细胞反应（MLR），观察DCs对同种T细胞的刺激能力.构建大鼠肾移植模型，于移植前7d输注FK506处理的DCs，观察移植肾存活时间.采用ELISA法检测MLR培养上清和移植大鼠

2、血清中TH1/TH2细胞因子IFNγ，IL2.freelus(FK506)onthedifferentiation,maturationandfunctionofratbonemarrousatconcentrationsof5-20μg/LtotheDCscultureandcheckedtheexpressionsofactivationmarkers(Iad,CD80andCD86)byfloetry,thereleaseofcytokinesIL12byELISAandthestimulatorycapacity

3、oftheresultedDCsbymixedlymphocytereaction(MLR).ThirtyCSF)与外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI1640培养基及胎牛血清（Gibco公司）；PE标记的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2，IFNγ的ELISA试剂盒（Bender公司）；3HTdR（AmershamLifeScience公司）.EpicXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司).1.2方法1

4、.2.1骨髓来源DCs的提取与鉴定参照文献［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，冲洗出骨髓细胞，以1∶10的体积比加入37℃预温的TrisNH4Cl去除红细胞；加GNK缓冲液终止反应，离心洗涤2次；用RPMI1640调细胞密度为1×109/L，37℃,50mL/LCO2条件下培养2h；轻轻洗去非粘附细胞；在贴壁细胞中加入含10μg/LrrIL4和10μg/LrrGMCSF的RPMI1640完全培养基，37℃,50mL/LCO2条件下培养6～7d，收集生长状态良好的DCs备用.1.2.2DCs表型与分泌IL12水平分析将

5、DCs分成4组，每组设3复孔：①对照组(DCs组)；②FK506处理组(FK506DCs组)：培养液中加入不同浓度FK506（5,10,20μg/L）；③脂多糖刺激组(LPSDCs组)：在培养结束前18h加入100μg/LLPS；④FK506处理+脂多糖刺激组(FK506LPSDCs组).在37℃,50mL/LCO2条件下培养7d，收集培养上清液，ELISA方法检测IL12水平（按试剂盒说明书进行）.收获细胞（2×109/L）；分别加入PE标记的抗Iad,抗CD80或抗CD86mAb(终浓度5mg/L)，4℃作用45

6、min；流式细胞仪分析，以中位荧光强度（MFI）作为检测指标.1.2.3体外混合淋巴细胞反应(MLR)分析取I1640培养基培养72h；于培养结束前18h每孔加入3HTdR3.7×104Bq；β计数仪测量待测细胞的3HTdR掺入值(cpm).1.2.4大鼠肾移植模型的建立与分组以SD大鼠为供体、LR中，加入3HTdR前收集培养上清；动物实验中，移植7d后抽取受鼠尾静脉血并分离血清，ELISA试剂盒说明书分别检测IFNγ,IL2,IL4和IL10水平.统计学处理：应用SPSS10.0软件包进行数据处理，两组间比较

7、采用随机分组t检验方法，多组间比较采用单因素方差分析方法，以P0.05为判定标准.2结果2.1DCs表型分析FK506DCs组Iad,CD80和CD86的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05).LPS刺激后,Iad,CD80和CD86的表达显著增加，与未处理组比较差异有统计学意义(P0.05)，但FK506对其无明显影响，LPSDCs组与FK506LPSDCs组比较差异无统计学意义(P0.05,表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)对DC表面分子表达的影响(略)2.2DCs分泌细胞因子I

8、L12检测在DCs培养的第7日,FK506DCs组培养上清中的IL12水平分别为:5μg/L组(105.0±9.5)ng/L；10μg/L组（74.4±6.6）ng/L；20μg/L组（41.7±3.9）ng/L.明显低于DCs组的(176.8±19.7)ng/L(P0