绿僵菌侵染有关基因腺苷酸环化酶基因之克隆及性能分析

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1、绿僵菌侵染有关基因腺苷酸环化酶基因之克隆及性能分析1绪论1.1引言农业害虫的防治是农业生产的一个重要组成部分，我国由于虫害造成的农业损失较严重且范围广。蝗虫传统的防治方法为施加化学农药，长期使用化学农药会导致一系列问题，如引起虫害的抗药性，使农药的药效降低，从而增加农药的生产成本；在杀死害虫的同时会杀伤其天敌，导致破坏生态平衡的严重后果；污染环境，产生毒素，使很多动物物种面临灭绝的危险；危害人体健康等等。随着人类环保意识逐渐的增强，化学农药的3R（害虫抗药性、再猖獗和有残毒）问题已越来越引起人们的关注，因此研究找寻到杀虫效率高、低不良残留、没有毒性、无公害的杀虫新农药就成为人们亟待要解

2、决的一个难题。目前，世界范围内，生物农药是研发较成功的一类杀虫农药，包括有微生物源的农药和植物源的农药。而微生物源的农药是重要的生物农药，包括病原真菌、细菌、线虫等，其具有使用有效期长、不易使昆虫产生抗药性、易被降解无残留、不杀伤天敌以及对人畜安全等优点。昆虫病原真菌作为一类重要的微生物杀虫剂，已被应用于农林虫害的防治，世界上，已被记载和报道的虫生真菌的种类繁多，有100多个属，将近有1000个种。在我国，已被报道的虫生类的真菌有大概405个种。这其中，虫草属有80种，寄生线虫类有10种，昆虫寄生类215种。现在，被研究和应用较多的生物杀虫真菌主要有白僵菌(Beauveris)、绿僵菌

3、(Metarhizium)、玫色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)等。而我国农业生产中，白僵菌被广泛用于蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、茶小绿叶蝉等多种农业卫生害虫的防治，而对松毛虫的防治的应用面积在世界居领先位置；而绿僵菌也已广泛规模化生产用于防治陆地害虫，如东亚飞蝗、天牛及多种蔬菜虫害。在澳、非洲等一些国家呢，绿僵菌被规模化生产使用，广泛地用在草原上、甘蔗及玉米等的害虫生物防治中。绿僵菌作为研究昆虫病原真菌的模式生物，现得到广泛应用，在昆虫防治中起着重要作用。绿僵菌属(Metarhizium)1883年由Sorokin建立起来的，隶属于子囊菌亚门下的核菌纲(Pyre

4、no-mycetes)，是球壳菌目(Sphaeriales)下的麦角菌科。对不同类的绿僵菌的分类及鉴定，开始是以绿僵菌菌落的形态差异及所生成的次生代谢产物的不同来区分的。随着新分子生物学等科学技术的发展，如今同工酶的酶谱类型、血清学、RNA和DNA分子核苷酸序列分析、随机引物扩增多态性(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)等现代生物技术已被运用来对绿僵菌属进行分类。绿僵菌主要通过在宿主的体表形成侵染器官侵入昆虫体内。作为新兴的生物杀虫剂，绿僵菌作为一类重要的生物防治真菌,可寄生多种昆虫，在生产中已得到了广泛应用，据不完全统计，全世界约有两百多种昆虫能被这种真菌感染，致死。其具有

5、触杀性，无污染，防止再猖獗等优点，同时绿僵菌在生产使用中仍存在一些缺陷：作用速度较化学农药缓慢，容易受到外界环境的影响，造价高。采用基因工程手段对菌株进行改造，提高毒力、杀虫速度以及抗逆能力是真菌杀虫剂面临的重要课题。目前，许多与毒力、抗逆相关的基因被逐步克隆，包括参与体表附着阶段的基因、参与表皮壁水解酶的基因、参与体壁穿透阶段的基因以及参与体内定植阶段的基因等。这些都为昆虫病原真菌菌株的改良奠定了良好的基础。对微生物的分子遗传改造需要对目的基因进行稳定重复的表达，通常，利用强启动子表达内、外源基因。转化技术作为现代分子研究的必要策略，是不同生物工程真菌遗传改造的重要技术。所以，使用先

6、进的技术对昆虫病原真菌的致病相关基因进行研究，分析其功能，阐明致病机理，以期提高野生菌株毒力，缩短致死时间，降低致死浓度，为选育出作用于宿主范围广、侵染率、致死率高的工程菌株及其产业化的发展提供理论支持，对昆虫病原真菌研究的有重大意义。1.2昆虫病原真菌致病机制研究背景及进展随着人们对病原真菌杀虫机制不断深入地研究，表明昆虫病原真菌能成功地侵染宿主主要地是凭借机械性压力作用和各种酶的作用。侵染机制是分生孢子首先粘附在昆虫体表上，受到物质刺激在体壁萌发发芽，分泌出来一些能降解昆虫体壁的酶类，如蛋白质和几丁质等，然后在芽管的顶部形成侵染结构附着胞，附着胞上再长出侵染钉，侵染钉可以产生强大的

7、压破力刺破了体表，使分生孢子进入昆虫的血腔，并在血腔中生长分化为很多菌丝，通过不断地增殖，真菌菌丝最后充满了昆虫整个体内，通过与昆虫自身大量地夺取营养并分泌一些毒素，导致虫体无法获取营养，而不能正常发育最终死亡。目前，对昆虫病原真菌的侵染机理的研究集中在侵染中分泌出的一些蛋白酶类、在侵染过程中发挥作用的一些信号途径和相互作用等，如：分生孢子是怎样粘着在体表的，如何夺取昆虫体内的营养，附着胞和侵染机构的形成过程，如何躲避宿主的免疫防御反应，以及真