金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因

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1、金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因筛选与体内定殖阶段cDNA文库构建本研究由国家自然科学基金资助项目编号：No:30771446重庆大学博士学位论文学生姓名：指导教师：玉先教授专业：生物医学工程学科门类：工学重庆大学生物工程学院二OO九年四月IdentificationofGenesDifferentiallyExpressedbyMetarhiziumanisopliaeInfectLocustamigratoriaandConstructionofcDNALibraryfromMetarhiziumanisopliaeintheHemolymphofLocustamigra

2、toriaTheresearchwassupportedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofChina.No:30771446AThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofDoctorofEngineeringBySupervisedbyyYYyProf.导师***Major:BiomedicalEngineeringCollegeofBioengineeringOFChongqingUniversity,Ch

3、ongqing,ChinaApril,2009中文摘要摘要金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）是一类重要的昆虫病原真菌，在害虫生物防治中起着重要作用。与化学农药相比，昆虫病原真菌开发的真菌杀虫剂作用时间持久、无环境污染、对非靶标生物安全，但存在致死时间长，杀虫效率低，防效不稳定等缺点，严重阻碍了真菌杀虫剂的广泛应用，为解决这一问题，在分子水平上揭示昆虫病原真菌致病机理尤为重要。金龟子绿僵菌侵染寄主昆虫时，分生孢子在体表萌发形成附着胞，并分泌多种蛋白酶类降解昆虫体壁，附着胞的形成与分化在侵染过程中发挥着重要作用。金龟子绿僵菌直接穿透寄主体壁进入体内，在血淋巴定

4、殖，以掠夺寄主营养或分泌毒素使寄主死亡，能否在体内成功定殖决定着侵染的最终结果。筛选附着孢形成时期和血淋巴定殖阶段的特异表达基因和基因表达分析对于研究昆虫病原真菌致病机理具有重要意义。EST序列分析和微阵列技术是研究昆虫病原真菌致病机理的成功策略，国内外许多研究者通过这种策略对绿僵菌侵染昆虫致病机理进行了深入研究，但采用的方法均是离体条件下，在各种液体培养基中加入诱导物培养，然后构建绿僵菌cDNA文库，大规模测序，进行EST序列分析。很明显，这些技术路线有一定的局限性，绿僵菌在离体液体培养环境下处于腐生生长阶段，而绿僵菌侵染昆虫过程处于寄生生活阶段，离体条件下诱导培养和事实的侵染

5、过程差别明显，很难对绿僵菌穿透寄主体壁机制，定殖寄主血淋巴适应机制作出完整的诠释，从而阐明病原真菌和寄主的相互作用关系。本研究以金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株CQMa102和东亚飞蝗（Locustamigratoria）为研究对象，从寄主血淋巴中分离出无寄主核酸污染的绿僵菌菌体，以已降解寄主核酸的东亚飞蝗翅膀诱导附着孢形成与分化，利用抑制消减杂交技术（SSH）筛选绿僵菌在附着胞形成时期和定殖血淋巴阶段的差异表达基因。DSN均一化和SMART技术相结合构建了金龟子绿僵菌CQMa102定殖东亚飞蝗血淋巴阶段的全长均一化cDNA文库，大规模测序，进行ES

6、T序列分析，分析绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段的基因表达特征，以阐明寄主和病原物之间的相互作用关系。主要研究结果如下：1．观察了金龟子绿僵菌CQMa102在实验条件下侵染东亚飞蝗的致病过程：发现24h左右分生孢子穿透寄主表皮进入血淋巴，接触血细胞，引起血细胞聚集；3天～6天大量的芽生孢子被血细胞吞噬、包囊；在寄主昆虫死亡前24h左右，血细胞数量急剧减少，芽生孢子开始迅速繁殖，血淋巴内悬浮着大量酵母状虫菌体101中文摘要（hyphalbody）。2．根据寄主血细胞和病原真菌细胞结构差别，建立和完善了利用蛋白酶K和SDS迅速裂解寄主血细胞的方法，整个流程时间约40min，RT-PCR检测表

7、明，利用寄主血细胞裂解释放的内源RNases和PBS洗涤可高效去除虫菌体中的寄主核酸污染，这一结论也被后续EST序列分析所证明。3.以寄主体内分离，去除寄主核酸污染的绿僵菌菌体提取mRNA为实验组（tester），使用RNAfragmentationbuffer处理东亚飞蝗翅膀，降解寄主核酸，并诱导附着孢形成与分化，以该时期的菌体提取mRNA为驱动组（driver），进行抑制消减杂交（suppressionsubtractivehybridization,SSH），筛选出350个