东亚飞蝗和金龟子绿僵菌几丁质酶基因克隆和表达的研究

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1、重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分，昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。几丁质代谢随昆虫不同生长发育阶段而变化并保持相对的稳定，对昆虫的正常生长发育是至关重要的。同时，穿透体壁是在昆虫病原真菌感染寄主的重要过程之一。几丁质酶基因转入植物或者生防微生物[如Bt或病毒)中表达，增加抗虫或杀虫效果。为此有必要加强几丁质酶的研究，为利用基因工程技术改良菌株奠定基础并提供目的基因。本文通过PCR方法分别从东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensi和金龟子绿僵菌蝗变种Meta

2、rhiziumanisopliaevat．acridum菌株CQMal02中克隆了几丁质酶基因，构建了酵母表达载体，通过毕赤酵母对获得的两个几丁质酶基因进行了表达研究，取得了如下进展：①东亚飞蝗中肠几丁质酶(LmChi)基因的克隆通过RACE方法，克隆了东亚飞蝗中肠几丁质酶(LmChi)cDNA全序Y0(登录号：EF092841)。获得的eDNA全长1604bp，其中开放阅读框l452bp，编码483个氨基酸。编码的氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样，东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几

3、丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。②LmChf基因的组织定位针对昆虫几丁质酶基因时序性表达的特点，本研究通过半定量RT．PCR法研究LmChi基因的组织表达情况。结果表明，LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达，而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。③金龟子绿僵菌蝗变种菌株CQMal02几丁质酶(MaChi)基因的克隆通过RACE和筛选基因组文库等方法，克隆了金龟子绿僵菌蝗变种菌株CQMal02几丁质酶(MaChi)基因的DNA和eDNA序列。部分序列已经登录到NCB

4、I数据库中(GenBank登录号：DQ097518)。MaChi基因DNA全序列l973bp，其中有三段内含子。eDNA全序列l483bp，蛋白编码区长1275bp，5’端非翻译区12lbp，3’端非翻译区80bp。编码的氨基酸序列与18家族几丁质酶有较高的相似性。同LmChi一样，绿僵菌几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点。但没有几丁质结合域。④LmChf基因和MaChi基因在毕赤酵母中的表达分别将LmChi基因和MaChi基因的成熟肽编码框连接到表达载体pPIC9K的多克隆位点上，构建了pPIC9K-LmCh

5、i和pPIC9K-MaChi重组表达质粒。重组质粒重庆大学硕士学位论文中文摘要经电穿孔法转化入毕赤酵母表达菌株KM71，PCR方法检测重组情况，筛选阳性转化子。转化子在甲醇的诱导下表达，表达产物上清液中成功的检测到了几丁质酶活性。关键词：东亚飞蝗，几丁质酶，半定量RT-PCR，金龟子绿僵菌，毕赤酵母II重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACT111ecuticleandtheperitrophicmatrixofinsectsactedasphysicalbarrierstopathogensandenvironmenta

6、lhazards．Bothwerecomposedprimarilyofchitinandprotein．ThedegradationofcMtinbychitinasewasvitalstepinthelifecycleofinsectsbecauseinsectsundergoperiodicecdysisandmetamorphosis．Theoldlayersofthecuticularexoskeletonshouldbedigestedpriortoecdysisandmetamorphosis．Duringthe

7、moltingprocess，chitinininsectcuticleWasdegradedbychitinase．Andpenetratinghost'scuticleisoneofthekeystepsinfungiinfection，too．SeveralchitinasegeneshavebeenisolatedandintegratedintotransgenicplantstoelLIlancetheirdefencemechanisms，andinsertedintoinsectpathogenstoincre

8、asetheirdeleteriouseffectsoninsects．So，researchonchitinasegenesmightprovideanimportantcluefortheutilizationoftheseenzymesasabiocontrolagen