钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建论文

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1、钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建论文.freelin）免疫小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA第一链，用简并引物经PCR分别扩增轻、重链抗体库，经重叠延伸PCR由Linker将轻、重链拼接成ScFv（单链抗体），用RS引物以ScFv为模板进行第2次PCR.freelentvariable）antibodylibrarybyphagedisplay.METHODSMicemunizedbyOUA-OVA（ouabain-ovalbumin）.mRNAthespleenlymphocyteandreverselytranscripted.Theheavy-chainandk

2、appalight-chainvariableregiongenes（VHandVL）repertoirsofim-munoglobinplifiedindividuallyandassembledintoScFvbyalinkerplifieder，meantimeSfiIandNotIrestric-tionsitesidpCANTAB5EandintroducedintoE.coliTG1byelectropo-ration.Phagemid-containingbacterialcoloniesmunizedentbly，theScFventafterEcoRIandHindⅢdig

3、estion.Trans-fectiontestindicatedthatthetiteroftheculturesupernatantAb的鼠源性而大大限制了其在临床上应用，由此相继出现了基因工程抗体和噬菌体抗体库技术.我们通过噬菌体展示技术制备钠泵抑制物（又称内源性哇巴因，endogenousouabain，EO）单链抗体库，以期从中筛选到钠泵抑制物单链抗体.1材料和方法1.1材料RNA及mRNA提取试剂盒分别为美国Gibco公司及美国Bio101公司产品.逆转录酶为Pharmacia公司产品.TaqDNA聚合酶为美国Promega公司产品;dNTP为Clontech公司产品.PCR引物

4、为Pharmacia公司产品，其中①Heavy-chainprimer1和2分别为VH基因5’端和3’端引物，用来扩增鼠IgVH基因;②Light-chainprimermix为10种VL基因引物的混合物，用来扩增鼠IgVL基因;③Linkerprimermix:序列为（Gly4Ser）3，该引物两端的各24个碱基分别与VH和VL基因的3’端和5’端相互补，从而可将VH和VL基因片段拼接成ScFv基因;④RSprimermix为带有SfiI位点的重链基因5’端引物和带有NotI位点的轻链基因3’端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点.噬菌粒载体pCANTAB5E为Pharm

5、acia公司产品.其中含有氨苄抗性基因（Ampr），Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段，用于克隆ScFv基因的SfiI，NotI克隆位点及Etag序列和瑚珀终止码TAG;⑤辅助噬菌体M13KO7为Pharmacia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr），在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒.细菌菌株TG1为Pharmacia公司产品，用于ScFv噬菌体表面展示.1.2方法［1-5］6in）免疫小鼠，每隔4RNA.参照Pharmacia公司的逆转录系统产品说明书，以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下37℃1h合成cDNA第1条链.以逆转录合成

6、的cDNA第1条链为模板，用通用引物进行全套VH和VL基因的扩增.纯化回收的VH，VL基因片段与Linkerprimermix以相同或接近等摩尔浓度混合进行重叠延伸PCR反应，从而将全套VH，VL基因随机拼接成ScFv基因库.以RSprimer为引物将拼接的ScFv扩增，同时在5’及3’端分别加上SfiI，NotI酶切位点.用SfiI和NotI消化ScFv，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶（5～7）U作用下进行连接.同时作载体自连和阳性插入（controlinsert）对照.用BioRad电转化仪将连接产物转化入TG1感受态细胞，37℃摇床1h后，取100μL

7、涂于SOBAG（含有100mgL-1氨苄青霉素和20gL-1葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上，30℃培养24h.从生长良好的SOBAG平皿上挑取12个单菌落提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定.取部分菌液加氨苄青霉素至终浓度为100mgL-1和葡萄糖至终浓度为20gL-1，37℃振荡培养（250rmin-1）1h.至对数生长期后，加入M13KO7辅助噬菌体，37℃振荡培养1h.离心，弃上清后将沉淀细胞再