兔抗人cd1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

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1、兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定：陈章权,黄震,梁晓东,何天文,陆田田【摘要】　　目的:制备兔抗人CD1d分子α3结构域（hCD1dα3）多克隆抗体。方法:PCR法扩增出人hCD1dα3编码区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导重组蛋白的表达,用Ni2+NTAAgarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、:Topreparetherabbitantibodyagainsttheα3dom

2、ainofthehumanCD1d(hCD1dα3).METHODS:ThegenefragmentcodingforhCD1dα3plifiedbyPCRandclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28,thenexpressedinE.coliBL21(DE3).TherebinantproteinhCD1dα3nandusedasimmunogentoimmunizetherabbit.Thetiterandspecificityoftheanti

3、hCD1dα3antibodyfromtherabbitmunohistochemistry,respectively.RESULTS:TherebinanthCD1dα3munohistochemistryanalysisshoanintestinaltissue.CONCLUSION:TheantiCD1dα3antibodyfromtherabbitmunogen,ain;expression;antibody;preparation　　CD1分子独立于MHC分子之外的一类特殊的抗原提

4、呈分子。CD1d是其CD1家簇5个成员中的重要一员,它提呈的抗原主要为脂质分子,供NKT细胞识别[1],在免疫调节、NKT细胞的发育及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发生发展过程中起重要作用[2-4]。CD1d分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成,其胞外区含3个结构域:从氨基端开始依次为α1、α2和α3结构域[5]。Kojo等[6]发现CD1d分子存在α3结构域缺失的变异体,但尚未见进一步的生物学功能研究报道。我们在研究中也发现,在一些肿瘤患者体内存在类似的CD1d变异体,这些突变的CD1d分子存

5、在的生物学意义尚不清楚,有待研究。抗体是研究免疫分子的重要工具,目前市场上尚未见有商品化的针对CD1d的α3结构域（CD1dα3）特异性抗体,也未见有该抗体制备的研究报道。为此,我们用通过PCR扩增获取了CD1dα3编码区基因,表达其重组蛋白,制备其特异性抗体,同时分析了其应用的可能性。　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存。雄性新西兰大白兔由广东医学院实验动物中心提供。克隆载体pGEMT、反转录试剂盒为Promega公司产品。RNA提取试剂、表达载

6、体pET28和Ni2+NTA凝胶为Invitrogen公司产品。Taq酶和限制性内切酶为大连宝生物工程公司产品。PCR产物回收、质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗兔IgG为Dako公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品。常规试剂为国产分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。　　1.2方法　　1.2.1CD1dα3编码区基因的克隆（1）人小肠组织总RNA的抽提和反转录反应:取手术切除的新鲜小肠组织,抽提RNA。

7、经电泳证实RNA无降解后进行反转录,操作按反转录试剂盒说明进行。（2）PCR扩增:根据GenBank中人CD1dcDNA序列,设计1对特异引物,引物1:5′CCATGGTGAAGCCCAAGGCCTGGCTG3′(划线部分为NcoI酶切位点),引物2:5′CTCGAGCAGGACGCCCTGATAGGAAG3′(划线部分为XhoI酶切位点),用以扩增CD1dα3编码区基因。PCR条件设定:94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,32个循环后,于72℃延伸7min。PCR产物经1

8、0g/L的琼脂糖凝胶电泳分析并回收纯化。（3）CD1dα3编码区基因的鉴定:将纯化的PCR产物与pGEMT载体连接后,转大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、Xgal和IPTG的LB平板上,于37℃培养过夜,挑取白色菌落进行培养,提取重组质粒,用EcoRI进行酶切鉴定,阳性克隆进行DNA测序,测序结果与GenBank中的DNA序列进行同源性比较分析,将质粒命名为pGEMT/hCD1dα3。　　1.2.2原核表达载体的构建用Nc