抗藤黄微球菌rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定

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1、抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定鼠后,获得了3株抗RpfdomainmAb,这3株mAb均特异性识别Rpfdomain多肽。结论:所获得的抗RpfdomainmAb特异性强、效价高,对进一步研究Rpfdomain在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具。【关键词】结核分枝杆菌藤黄微球菌RpfdomainmAb　　结核病是现今全世界范围内最重要的致病和致死因素之一。目前,全世界约有1/3的人感染,每年约800万的新发病例和300万的患者死亡,我国就有500万肺结核患者,位居世界第二。处于结核分支

2、杆菌感染状态而未发病的人群（主要是成年人）中只有10%有可能最终发展成为活动性结核病患者,而绝大多数以潜伏感染的形式存在,此时结核杆菌处于休眠状态,当机体免疫力低下时,休眠的结核菌激活引发结核病。　　Mukamolova等[1,2]发现在藤黄色微球菌（Micrococcusluteus）种发现了一种能促进细菌复苏生长的因子,被命名为复活促进因子（resuscitationpromotingfactor,Rpf）。Biketov等[3]则发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态。通过同源

3、性分析发现,结核分枝杆菌（MTB）基因组可编码5种Rpf样蛋白,Rpf样蛋白存在于多种富含G+C的革兰氏阳性细菌中,基因所编码的蛋白均具有Rpf样作用域,单独的Rpf作用域具有与Rpf样蛋白一致的生物学功能[4]。本研究中,我们克隆表达并纯化藤黄微球菌Rpf结构域多肽,将表达的蛋白纯化后作为免疫原,制备了高特异性、高效价的mAb,并进行了特异性鉴定。　　1材料和方法　　1.1材料　　藤黄微球菌标准株、E.coliDH5α为西京医院检验科细菌室保存;TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4连接酶、HindⅢ、BamH

4、Ⅰ及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、PEG、HT及HAT购自Promega公司;pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠;Sp2/0细胞系由第四军医大学微生物教研室馈赠;BALB/c小鼠（雌性,6～8周龄）由第四军医大学动物实验中心提供;6HismAb购自第四军医大学免疫学教研室;HRP山羊抗小鼠IgG抗体购自华美生物公司;Ni2+NTA纯化试剂盒购自Invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季清公司;其余试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1引物的设计　　登陆G

5、enBank,根据藤黄微球菌Rpf结构域基因序列设计引物。P1:5′AGTGGATCCGCCACCGTGGACACCTG3′含BamHⅠ酶切位点;P2:5′CTGAAGCTTTTACAGCTTCTGCGAGCACAG3′含HindⅢ酶切位点和终止码。扩增片段为253bp,由TaKaRa公司合成。　　1.2.2藤黄微球菌基因组DNA的提取　　刮取适量藤黄微球菌落,TE(pH8.0)洗涤后重悬,加SDS至终浓度为10g/L,蛋白酶K至终浓度0.1g/L,55～60℃水浴过夜,分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(2

6、5∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次,上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇,1/10体积3mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1h沉淀DNA,用无水乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次,抽干后溶于适量无菌水中。　　1.2.3藤黄微球菌Rpf结构域基因的扩增、克隆及测序　　以藤黄微球菌基因组为模板,以P1和P2为引物,扩增目的基因。PCR反应条件:94℃60s,57℃60s,72℃90s,共30个循环,再于72℃延伸7min。回收PCR产物,经BamHⅠ和HindⅢ消化后,然后用T4连接酶连接入经同样酶

7、消化的pUC19中,转化E.coliDH5α感受态细胞。然后涂布于lB平板（含氨苄青霉素100mg/L）,随机筛选4个菌落,分别接种于5mL含氨苄青霉素的lB培养液中,37℃振荡培养过夜,提取质粒DNA,用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,37℃过夜,进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳,以DL2000为Mr参照,观察有无约253bp大小的片段,将阳性克隆命名为pUC9Rpfdomain,然后随机挑取3个克隆进行测序。　　1.2.4重组质粒的表达　　提取测序正确的重组克隆质粒,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,回收目

8、的基因条带,溶于50L双蒸水中。取目的片段和同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pProEXHT质粒以3∶1的比例混合,用T4连接酶连接,转化E.coliDH5α感受态细胞。然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L）,37℃培养过夜。随机挑取4个菌落,分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡培养过夜。各取1.5mL提取质粒DNA,再以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴