毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白

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1、毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白第33卷第5期2006经北京化工大学JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGYVo1.33.No.52006毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白陈思任锐陈劲春(北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029)摘要:将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后,流加亚硒酸钠,同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠),通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量,判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质

2、中.发酵液经热处理,超滤,离子交换和丙酮沉淀等步骤后,进行Tricine-SDSPAGE凝胶电泳,x射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析.结果表明,加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%,硒与蛋白质的质量比为0.0069,高于对照发酵液近35倍,初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化,转化为硒代氨基酸,并形成硒代重组蛋白质.关键词:亚硒酸钠;重组人血清白蛋白;毕赤酵母中图分类号:Q939.9引言人体的营养元素硒具有延缓衰老,修复机体组织和抑制癌症等作用L1J.目前,硒的补充主要通过无机硒化合物,人工合成有机

3、硒化合物以及富硒酵母来实现.但是硒的无机化合物多具有毒性,易引起不良反应,而注射给药途径限制了有机硒化合物的应用【2J.本试验是根据加入亚硒酸钠后酵母便可以产生硒代氨基酸的思路【3J,把转基因毕赤酵母在含硒基质中培养,以期硒在酵母细胞内以硒氨基酸(SeMet,SeCys)的形式参与重组蛋白质的合成,从而得到营养价值高,毒性极小,利于吸收利用的硒代重组蛋白质.人血清白蛋白(HSA)有很高的药用价值【4],硒代人血清白蛋白即可作为白蛋白补充剂又可以作为有机硒抑制癌症,提高免疫力,增强组织修复能力,具有很大的市场潜力.硒

4、代人血清白蛋白作为单纯的营养保健品投放市场,与现有的硒营养品相比,其成分更加明确,安全性,有机纯度和营养价值更高.1材料和方法1.1供试菌株PichiapastorisGS115/rHSAMut为本实验室收稿日期:2005—11—15第一作者:女,1982年生,硕士生*通讯联系人E?mail:jingchunchen@hotmail.tom构建.1.2培养基种子培养基YPG:酵母提取物1.0%,大豆蛋白胨2.0%,甘油2.0%;基础盐培养基BSM:硫酸钙0.93g/L,硫酸钾18.2g/L,七水硫酸镁14.9g/L

5、,柠檬酸三钠1.47g/L,微量元素2mL/L'甘油40g/L,硫酸铵10g/L,磷酸钾缓冲液(pH6.0)0.1mol/L.微量元素主要成分:五水硫酸铜6.0g/L,碘化钾0.08L,一水硫酸锰3.0g/L,二水钼酸钠0.2L,硼酸0.02g/L,硫酸钙0.5g/L,氯化钴0.5g/L,氯化锌20.0g/L,七水硫酸亚铁65.0g/L,硫酸5.0mE/L,生物素0.2g/L.试剂均为国产生化试剂纯或分析纯.1.3实验方法1.3.1发酵将50L种子液接种于5mL的YPG培养基中,30℃振荡培养18—22h,转接到装

6、有100mL基础盐培养基的500mL带挡板的摇瓶中.转速180r/min,温度30℃培养,每8小时用浓氨水调节发酵液pH值至6.0.约48h时,取样检测甘油浓度,待甘油耗尽后加入甲醇开始诱导.诱导期培养温度为28℃,pH值调节至7.0[],每12h补加体积分数0.5%的纯甲醇和10mg/L的亚硒酸钠.对照发酵液不添加亚硒酸钠.诱导96h后停止发酵.1.3.2发酵液的浓缩和脱盐将发酵液于7200r/min离心5min,收集上清液;上清液60℃热处理3h使蛋白酶失活,10000r/min离心10rain得到热处理上清液

7、;热处理上清液用截留分子量为30k的中北京化工大学2006正空纤维超滤膜进行脱盐浓缩并除去小分子杂蛋白.1.3.3离子交换层析经过脱盐的上清液流入DEAESepharoseFF阴离子交换树脂柱,用紫外检测仪于280nm在线检测,收集洗脱峰.上样条件为0.005mol/L的磷酸钠缓冲液,pH值6.4;洗脱液为含有0.20mol/LNaC1的磷酸钠缓冲液,pH值8.0[7..1.3.4蛋白质的沉淀收集采用丙酮沉淀法¨8J沉淀10mL经离子交换后的洗脱液.上清液蒸除丙酮后电泳检测;沉淀用1.5mL去离子水重新溶解后,10

8、000r/rain离心10min得上清液进行电泳和原子吸收分析硒含量.1.4分析方法测定所取发酵液中的细胞干质量¨9J,再除以所取发酵液体积即得细胞质量浓度;高碘酸钠氧化法[m]测定甘油浓度;考马斯亮兰染色法[¨]测定总蛋白质量浓度;Tricine—SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量;X射线能量色散谱分析(EDX)及原子吸收光谱法测定硒含量.2结果与讨