巴斯德毕赤酵母表达系统

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1、巴斯德毕赤酵母表达系统报告人：彭平平起源及背景巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是8O年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。30年前KoichiOgata首次发现有些酵母可以利用甲醇为唯一的碳源和能源.70年代Philipspertoleum公司就开发出高密度连续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。80年代由Philipspertoleum公司合作开发毕赤酵母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。1993年Philipspertoleum公司委托Invrtigone公司代

2、理毕赤酵母表达系统的产品。毕赤酵母与其它表达系统相比有许多优点1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcoholoxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物

3、，且聚糖末端不含1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低结构特点一、单细胞微生物1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量的蛋白二、微体（也称过氧化物酶体）1、合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，亦不会对细胞产生毒害2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在AOX催化下产的H202对细胞的毒害。醇氧化酶（AOX）甲醇AOX甲醛H2O2微体细胞毕赤酵母质粒载体几个概念同源基因重组：同源染色体的非姐妹

4、染色单体的交叉互换引起的互换重组穿梭质粒：是指人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。pPIC9k质粒图谱AOX--醇氧化酶S---分泌信号MCS–多克隆位点TT---终止信号HIS4--组氨醇脱氢酶Kanamycin---抗卡拉霉素基因pBR322---大肠杆菌的复制起始位点Ampicillin---抗氨苄青霉素基因外源蛋白的引入表达菌株类型Mut表型与甲醇利用率Mut5’AOX基因3’AOX基因表型Mut+存在存在正表型Muts缺失存在缓慢型Mut-缺失缺失负型选择过程HIS4缺陷培养基G418酵母培养基低高G418：是一种氨基糖苷类抗生

5、素，Kanamycin抗性基因能对抗G418对酵母的毒性导入质粒发酵过程一般分为三个阶段：①成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；②过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；③诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中流加甲醇诱导重组蛋白的表达。应用举例依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白ExenatideTwiceaday2.4h被代谢ExenatideHSAPCR基因重组ExenatideHSAOnceawee

6、k毕赤酵母表达外源蛋白示例谢谢大家！！