免疫酶组织化学技术

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1、免疫组织化学和ELISA10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net基本原理抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位、定量组织或细胞内抗原的技术。10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net免疫组化免疫学(抗原抗体反应)酶细胞化学(底物显色反应)+特异性敏感性定位性可视性10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net免疫组织化学基本组成：抗原↓抗体↓放大系统↓显色系统10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net免疫组化特点：信号定位准确定性检

2、测标本可长期保存方法简便10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net一、酶选择标准：★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。★酶反应产物稳定，不扩散，具有良好定位。显色系统：酶和底物10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net★易于纯化，获得纯制品。★与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net符合上述条件：辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶10/23/2021小木虫经典出品（C

3、）emuch.net（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色★HRP穿透力强，易进入细胞内10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取●组织穿透能力较弱●内源性AKP较高●左旋咪唑具有抑制作用10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳

4、定●体内无内源性GOD●分子量大，穿透力较弱10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net二、底物及其特点酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色）10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.netHRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.netHRP显色反应：HRP＋H2O2HRP＋H2O＋电子供体（氧化型）电子供体电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。10/23/2021小木虫经典

5、出品（C）emuch.netHRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久存●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)～黄色10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.netAKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.netI酶标记抗体法酶标记抗体法（EnzymeLabelledanti

6、body）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。(直接法、间接法）10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法一、直接法HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体●HRP复合物特点：一步完成，方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net组织抗原第一抗体第二抗体过氧化物酶间接法二、间接法HRP标记在第二抗体，抗原-特异性抗体-第二抗体●HRP复

7、合物特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.netII:卵白素---生物素系统Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素AvidinABC法一、ABC法（AvidinBiotinComplex）原理：酶标记Biotin形成酶素化Bioti

8、n酶素化Biotin＋Avidin---ABC复合物抗原---特异抗体---Biotin标记第二抗--Avidin●Biotin●HRP10/23/2021小木虫经典出品（C）emuch.net特点：三步法，敏感性较高，特异性强，应用范围广，但某些组织中存在高内源性生物素干扰Avidin与