western+实验操作程序

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1、Westernblot实验操作程序一、储存液的配制：1.)1.5MTris-HCl（PH8.8）：100mlTris18.15g去离子水50ml缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4ml），冷却至室温后再加去离子水至100ml.2.)0.5MTris-HCl（PH6.8）：100mlTris6.05g去离子水50ml缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100ml..3.)10%SDS（W/V）：100mlSDS10g去离子水100ml溶解后，室温下保存。4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油50ml去离子水50ml

2、混匀后，室温下保存。5.)1%溴酚蓝：10ml溴酚蓝100mg去离子水10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6.)丽春红S(PonceauS)储存液：100ml丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g去离子水100ml混匀后，室温下保存。7.)10×转膜液：1000ml甘氨酸90gTris19.3g加去离子水至1000ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：1.组织（或细胞）裂解液：3ml或5ml试剂初始浓度终浓度3ml5mlNaCl1mol/L0.1mol/L300μl500μlTris-HCl1mol/L0.01mol/L30μl50μ

3、lEDTA0.5mol/L0.001mol/L6μl10μlAprotinin1mg/ml0.001mg/ml3μl5μlPMSF10mg/ml0.01mg/ml30μl50μlTritonX-1003%1%1ml1.6ml去离子水1.64ml2.8mlPMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。2.5×变性lo

4、ading:10ml1MTris-HCl（PH6.8）0.6ml60mM50%甘油5ml25%10%SDS2ml2%1%溴酚蓝1ml0.1%去离子水0.9ml混匀，在4oC下可保存数月。3.丙烯酰胺储存液（30%）：100ml丙烯酰胺29g双丙烯酰胺1g去离子水100ml丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。搅拌至完全溶解，在4oC下可保存数月。4.4´分离胶缓冲液：100ml2MTris-HCl（PH6.8）75ml1.5M10%SDS4ml0.4%去离子水21ml混匀后可在4oC下保存数月，配

5、分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4´的缓冲液即可5.4´堆积胶缓冲液:100ml1MTris-HCl（PH6.8）50ml0.5M10%SDS4ml0.4%去离子水46ml混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4´的缓冲液即可6.10%过硫酸胺(APS)：5ml过硫酸胺0.5g去离子水5ml分装后，保存于-200C7.电泳缓冲液:1000mlTris3g25mM甘氨酸14.4g192mMSDS1g0.1%加去离子水至1000ml，PH在8.3左右。8.考马斯亮蓝染色液:1000ml考马斯亮蓝R-2501.0g甲醇

6、450ml冰醋酸100ml去离子水450ml需过滤后使用，可用来染蛋白质.9.考马斯亮蓝凝胶脱色液:1000ml甲醇100ml冰醋酸100ml去离子水800ml可使染色的凝胶脱色,以减低背景。10.丽春红S工作液：100ml丽春红S储存液10ml去离子水90ml可用来染蛋白质.11.1´转移缓冲液：1000ml10×转移缓冲液100ml甲醇200ml去离子水700ml可回收利用三、操作步骤：1.组织（或细胞）的裂解：取所需的组织，如：脑、脊髓或其他组织，操作时动作要快且最好在冰上进行。将其转移到已清洗干净并烘干后的匀浆器中，加裂解液进行匀浆（裂解液的

7、量根据组织块的大小确定），匀浆时需将匀浆器置于碎冰块中，且匀浆时间不能太长（约3-5分钟，或匀浆器抽拉30-40次），抽拉时动作要慢，以减少气泡的产生。若要裂解细胞，所加的裂解液量不能太多，以免蛋白质浓度太低，不易检测。若取培养基收集蛋白质，则不须裂解2.离心：先启动离心机预冷，将温度降至4℃，将裂解后的溶液转移至小管中，（根据溶液的量选取大小合适的小管），速度要快，以免蛋白质降解，将小管平衡好之后，放入离心机中离心，转速3000—5000转/分为宜，离心时间15分钟左右。3.蛋白质的变性处理：将离心后的小管取出，吸取上清，转移至另一小管中，吸取时要

8、小心，不要将沉淀吸出，向小管中按4：1的比例加变性loading，将盖子盖好，用胶带缠紧，将小管插入到一塑料