改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究论文

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1、改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究论文王冠军，孙明学，卢世璧*，许文静，赵斌，彭江，张莉，黄靖香【摘要】目的］改进去细胞异体神经化学萃取制备方法.freela公司。1.3去细胞异体神经的分组及制备取14只大鼠，用10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉后,切取双侧坐骨神经，每根神经长约20mm，共28根神经。仔细剔除神经外脂肪、血管及结缔组织。分3组进行处理：Sondell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为：TritonX-100和脱氧胆酸钠，

2、步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12h；（2）3%TritonX-100溶液中振荡萃取12h；（3）4%脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；（4）重复上述步骤1次；（5）蒸馏水冲洗30min。改良法组所用萃取剂为：TritonX-200、SB-10和SB-16，步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12h；（2）125mmol/LSB-10溶液中振荡萃取12h；（3）0.14%TritonX-200和0.6mmol/LSB-16溶液中振荡萃取24h；（4）重复上述步骤1次；（5）PBS（pH=7.2,下同）冲洗3

3、0min。2种方法处理均在25℃下进行，处理后的神经于4℃下、PBS液中储存备用。对照组神经不作化学处理。1.4去细胞异体神经的组织学评价1.4.1光镜观察3组各取神经6、6、4根，于各神经同位置处切取神经（横向切片取5mm长神经，纵向切片取10mm长神经），常规石蜡包埋,厚为5μm的横向和纵向组织学切片；HE染色,观察去细胞程度和围绕神经轴突的基底膜管结构的完整性；快蓝染色,观察髓鞘残留成分；基底膜素免疫组化染色，观察基底膜素的保留。1.4.2扫描电镜观察3组各取神经4根，于2%OsO4（2%锇酸

4、）溶液中固定24h后，二甲胂酸钠缓冲液冲洗，滤纸蘸干水分，投入液氮中冷冻，取出后迅速切成5mm小段，于冷冻干燥机中干燥固定后，环境扫描电镜下观察基底膜管结构的完整性及去髓鞘程度。1.4.3去细胞异体神经质量评价按下述评分标准［2］：（1）去细胞程度：去细胞完全评为0分，残余细胞占总数的百分率≤25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别评为1、2、3、4分；(2)髓鞘染色分级：（－）、（±）、（＋）、（＋＋）分别评为0、1、2、3分；(3)基底膜管完整性：结构完整无破坏评为0分，结构破坏占总

5、面积的1%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别评为1、2、3、4分。正常神经各组织学染色作为对照。由病理专业人员按去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性观察的标准，行双盲观察计分，综合评分，分数越低，表示制备的质量越好。1．5统计学分析用SPSS11.5统计分析软件进行数据处理，组间对比用成对资料的t检验，P0.05时，有显著性差异。2结果2.1物理性状Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经，在外观上无明显差别，均呈淡乳白色、略透明外观，其直径和长度均略小于化学萃取前的新鲜神经

6、。牵拉2种方法制备去细胞异体神经，其延展性均较化学萃取前略增加。显微镜下行神经外膜缝合操作，感其韧弹性略差于新鲜神经，但均可在无张力下行常规的神经吻合，改良法制备的去细胞异体神经韧弹性略好于Sondell法，但无统计学意义。2.2常规组织学观察2.2.1HE染色正常神经可观察到轴突、雪旺细胞及细胞外基质等结构。Sondell法组与改良法组中纵切片上均见不到任何细胞，红染的神经内膜呈波浪状纵形排列，轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙；横切片上轴突及细胞均消失,代之以红染的神经内膜形成的不规则圆形空腔，

7、周边可见到红染的神经束膜及外膜。Sondell法组在纵切片中于红染的神经内膜之间出现了大的空隙；在横切片中于红染的经内膜圆形空腔间出现了大的空隙，而改良法组在纵、横切片，神经内膜管的排列均匀一致，均未出现大的空隙（图1a、1b）。2.2.2快蓝染色正常神经可观察到蓝色的髓鞘和蓝黑色的细胞核结构。Sondell法组与改良法组中均显示细胞完全消失、髓鞘大部分消失。Sondell法组残留的髓鞘染色较重，改良法组较轻（图2a、2b）。2.2.3基底膜素免疫组化染色正常神经纵切片上,染成金黄色的基底膜素呈带状

8、纵形排列；横切片上，黄染的基底膜素绕在轴突的外周，形成不规则圆形空腔。Sondell法组与改良法组中均可见到大部分黄染的基底膜素的保留。Sondell法组中基底膜素染色较轻，改良法组较重。2.3环境扫描电镜观察正常神经可由髓鞘和基底膜环绕形成的圆形小空腔，空腔管壁完整无破坏。Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经均可见到基底膜保留，管腔扩大。Sondell法制备的去细胞异体神经可见到较多的空腔管壁不完整，相互融合连成大的空腔。改良法中小空腔排列规范，管壁破坏的较