化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果

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1、化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果王冠军卢世璧孙明学许文静张莉郭全义彭江赵斌【摘要】　　目的：改良去细胞异体神经的制备方法，研制出一种理想的自体神经移植替代物.方法：将用Sondell法（TritonX100、脱氧胆酸钠）和改良法〔TritonX200，sulfobetaine10（SB10）,sulfobetaine16（SB16）〕两种方法制备的去细胞异体神经用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色、扫描电镜检查等进行组织学评价.然后将制备的神经桥接大鼠坐骨神经缺损，从坐骨神经指数、

2、神经电生理、运动终板染色等方面评价神经移植后的再生效果.结果：改良法制备的神经细胞及髓鞘去除彻底、结构保存完好；移植后神经再生良好，优于Sondell法制备的神经，达到了与自体神经移植相当的再生效果.结论：综合运用萃取剂TritonX200,SB10和SB16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植.【关键词】周围神经化学萃取去细胞异体神经神经再生神经缺损0引言周围神经缺损的修复是临床上的难题，目前主要采用自体神经移植修复，但此方法有诸多缺点，且常

3、因供体有限，无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要〔1〕.异体神经来源广泛，但新鲜异体神经移植会出现导致移植失败的免疫排斥反应.采用化学萃取方法能较好地降低异体神经的免疫反应〔2-3〕，但由于处理方法的不同，有时对神经的结构破坏太大〔2〕.本研究旨在改良去细胞异体神经的制备方法，即综合应用萃取剂TritonX200，sulfobetaine10（SB10）和sulfobetaine16（SB16），并与目前得到认可的Sondell化学制备方法（应用萃取剂TritonX100和脱氧胆酸钠）进行比

4、较；并将改良制备的异体神经桥接周围神经缺损，评价其再生效果，以期研制出一种理想的自体神经移植替代物.1材料和方法1.1材料健康成年SD大鼠26只，雌雄不拘，体质量270～300g，用于去细胞异体神经制备.健康成年edtronicKeypoint，丹麦）；TritonX100，脱氧胆酸钠，TritonX200，SB10，SB16(美国Sigma公司).1.2方法1.2.1去细胞异体神经制备将SD大鼠26只用100g/L水合氯醛以0.4μL/g腹腔注射麻醉后,切取双侧全长坐骨神经，每根神经长约20mm.分3组进行

5、处理：Sondell法组（10只）、改良法组（10只）和对照组（6只）.Sondell法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12h；②30g/LTritonX100溶液中振荡萃取12h；③40g/L脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；④重复上述步骤1次；⑤蒸馏水冲洗30min.改良法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12h；②125mmol/LSB10溶液中振荡萃取12h；③1.4g/LTritonX200和0.6mmol/LSB16溶液中振荡萃取24h；④重复上述步骤1次；⑤0.01mmol/LPBS（pH7.2,下

6、同）冲洗30min.处理后的神经于4℃的PBS液中储存备用.对照组神经不作化学处理.1.2.2移植手术将)观察示Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经均可见到基底膜保留，管腔扩大.Sondell法制备的去细胞异体神经可见到较多的空腔管壁不完整，相互融合连成大的空腔.改良法中小空腔排列规范，管壁破坏的较少，较少见到融合的大空腔(图2).综合质量评分：经配对资料t检验，t1=0.542，P1=0.611＞0.05；t2=3.162，P2=0.0250.05；t3=2.712，P3=0.042＜0.05；t4=3

7、.344，P4=0.004＜0.05.其中，t1，t2，t3，t4分别指Sondell法组与改良法组间在去细胞程度、髓鞘染色分级、结构完整性以及综合质量评分的统计量.2．2移植后神经再生效果评价2.2.1大体观察术后3o，自体神经移植组为-40.81±7.38；sondell法组为-71.25±7.44；改良法组为-46.53±6.81，经成组资料t检验，sondell法与改良法：t1=6.2165,P1=0.0008＜0.05，有统计学差异，改良法优于sondell法.改良法与自体移植：t2=1.4487,P2

8、=0.1976＞0.05，无统计学差异，改良法与自体效果相似.Sondell法与自体移植：t3=5.8095,P3=0.0011＜0.05，有统计学差异，sondell法差于自体移植.A:Sondell法组，去细胞完全，神经结构破坏较重;B:改良法组，去细胞完全，神经结构破坏较轻.2.2.2肌电图检测术后3mo时,sondell法组的运动神经传导速度为39.7±3.6，改