纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白论文

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1、纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白论文【摘要】建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰，在其表面固定特异性蓖麻毒单抗并作为探针，用于蓖麻毒蛋白的检测。采用场流分离技术对纳米颗粒探针进行准确表征，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。结果表明：通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合，应用于目标蛋白的检测。【关键词】纳米颗粒探针;蓖麻毒素;核糖体失活蛋白;场流分离;扫描电镜;聚苯乙烯1引言核糖体失活蛋白(Ribosomeinactiva

2、tingproteins,RIP)存在于许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或者恶劣的环境1。根据蛋白质的一级结构.freel的悬浮物颗粒,也可作为一种表征技术对样品中纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支，其中沉降场流分离(SedimentationfieldfloTechnologies,UK);NAP5及NAP10凝胶渗透柱(通用公司);5417C离心机(德国Eppendrof公司)。蓖麻毒素A链(RicinAChain,纯

3、度98.99%)及其单抗IgG均由美国农业部西部研究中心友情提供;聚苯乙烯纳米颗粒(240nm，10%，a公司。2.2实验方法2.2.1离心沉降分离检测技术场流分离技术可视为一种单相的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)11～13。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进入通道后，样品将暂停一段时间(即Relaxationtime，停留注射或松弛步骤)。此时样品中的不同组分由于物理性质的差异，在外加场的作用下，靠近通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速差

4、别会导致其相应的保留时间较大的差异，在流体及外加场的联合作用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构18及分离原理如图1所示。分析化学第38卷第5期全灿等：纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白图1(a)沉降场流分离仪结构图18和(b)沉降场流通道分离原理示意图Fig.1(a)Structurediagramofthefieldflo18and(b)eofFFFchannel纳米颗粒在尺度为940mm×20mm×0.254mm的线型光滑通道中进行，该通道的空隙保留体积为4.49mL，死体积为0.439mL，外加场为离心力场。检测时将线型光滑通道置于离心场中随

5、离心机轴向旋转，距离离心机轴的径向距离为15.5cm。流动相为流速为1.5mL/min的0.1%FL70溶液。样品进样体积为10μL，松弛时间为12min以确保样品在分离通道中平衡，离心机转速500～2000r/min，紫外检测器波长为254nm。聚苯乙烯纳米颗粒的密度为1.053g/cm319。利用振动管密度计测定0.1%FL70的流动相密度为997.1kg/m320。2.2.2纳米颗粒表面修饰利用修饰剂F108PDS对聚苯乙烯表面进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂F108PDS(10g/L)加入到聚苯乙烯纳米颗粒悬浮液中

6、，在一定条件下使聚苯乙烯颗粒表面物理吸附足够量的修饰剂F108PDS，经分离机离心分离未结合或结合不紧密的修饰剂F108PDS，弃去上清液后用磷酸盐缓冲液重新稀释纳米颗粒，重复上述步骤3次并合并悬浮液涡旋混合，取10μL纳米颗粒悬浮液样品进行离心沉降分析。2.2.3蓖麻毒单抗表面修饰利用修饰剂SPDP对蓖麻毒单抗进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂SPDP加入到蓖麻毒单抗溶液(2.0g/L)中，在一定条件下反应后，利用NAP5柱分离除去过量的修饰剂SPDP及一些小分子反应产物，再加入适量修饰剂DTT，再利用NAP10柱分离除去

7、过量的修饰剂DTT。2.2.4纳米颗粒固定单抗将端基化的抗体与经表面修饰后的聚苯乙烯纳米颗粒温和反应，离心除去未结合及结合松散的抗体上清液，用缓冲盐再次悬浮并涡旋混合，再离心沉淀的纳米颗粒，即得到具有特异性抗体修饰的纳米探针颗粒，取10μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体结合的程度。2.2.5蓖麻毒蛋白的检测取5μL蓖麻毒蛋白，加入到2.2.4节制备得到的纳米颗粒探针中，恒温反应。取10μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体与蓖麻毒蛋白的结合程度。2.2.6扫描电镜法将固含率为1%的聚苯乙烯纳米颗粒悬浮,液滴在带有碳膜的电镜用

8、铜网上，待悬浮液中的载液用氮气吹干后，利用离子溅射仪进行离子溅射镀