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1、XX大学毕业论文纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白姓名：2014年6月25日纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白【摘要】建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰，在其表面固定特异性篦麻毒单抗并作为探针，用于蘆麻毒蛋片的检测。采用场流分离技术对纳米颗粒探针进行准确表征，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。结果表明：通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋口，此纳米颗粒探针能够与龍麻毒蛋口等核糖体失活蛋白的特异性结合，应用于目标蛋白的检测。【关键词】纳米颗粒
2、探针；萬麻毒索；核糖体失活蛋H；场流分离；扫描屯镜;聚苯乙烯1引言核糖体失活蛋A(Ribosomeinactivatingproteins,RIP)存在于许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或者恶劣的环境［l］o根据蛋口质的一级结构，RIP可以分成两类：I型，由一条多肽链组成;II型，是双链蛋白。II型双链RIP由2条或者4条多肽链组成，分子量约为60或120kDa,其中一条是A(Active)链，貝有N糖苜酶活性;另一条是B(Binding)链，这两条链通过二硫键和非共价键连接
3、［2,3］。萬麻毒是一种典型的核糖体失活蛋白，由于崑麻毒来源广泛，禁止化学和生物武器公约把崑麻毒列为最为严格的控制对［4,5］o因此，开展对匏麻毒等核糖体失活蛋白的检测研究具有重要意义［6〜8］。目前，检测核糖体失活蛋白的方法冇免疫分析法和生物质谱法［9〜11］。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原了所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白检测中［12,13］。场流分离(Fieldflowfractionation,FFF)是Giddings提出的一「种新的分离分析理论［14,15］,它将流体与外
4、加场联合作用于样品，实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中范围为0.02〜1屮n的悬浮物颗粒，也可作为一种表征技术对样品屮纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支，其中沉降场流分离(Sedimentationfieldflowfractionation)技术较为完善JUL应用较多［16,17］。本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋口的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表而修饰后在英表而同定特异性单抗
5、，利用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分了数目，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与核糖体失活蛋白的特界性结合，可应用于目标蛋口的检测。2实验部分2.1仪器与试剂沉降场流分离仪(Postnova,UT,USA);AntonPaarDMA(60/602)振动管密度计(奥地利AntoPaar公司)；场发射扫描电镜(LEO1550EDS/OPAL/EBSD/STEM,Zeiss,Thor
6、nwood,USA);SputterCoaterSC7640离子溅射仪(QuorumTechnologies,UK);NAP5及NAP10凝胶渗透柱(通用公司);5417C离心机(德国Eppendrof公司)。匏麻毒素A链(RicinAChain,纯度98.99%)及其单抗IgG均由美国农业部西部研究中心友情提供；聚苯乙烯纳米颗粒(240nm,10%,w/V,BangsLaboratoriesInc.PA,USA);NH4HCO3(99.5%)、表面活性剂FL70(Fisher公司)；实验用水为MilliQ超
7、纯水(18MQ)O纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(F108PDS)、3(2毗I定二疏基)丙酸N轻基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和磷酸盐缓冲液，pH7.4)购口Sigma公司。2.2实验方法2.2.1离心沉降分离检测技术场流分离技术可视为一种单相的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)[11〜13]。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进入通道后，样品将暂停一段时间(即Relax
8、ationtime,停留注射或松弛步骤)。此时样品屮的不同组分由于物理性质的差异，在外加场的作用下,靠近通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速差别会导致其相应的保留吋间较大的差异，在流体及外加场的联合作用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构[18]及分离原理如图1所示。分析化学第38卷第5期全灿等：纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白图1(a)沉降场流分离仪结构图[18]和(
