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时间:2018-07-12
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1、邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量一、实验原理: 邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,中间物的积累在滞留30~45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。二、实验试剂:这个液体貌似是不能研磨的,而且本身就是酶,正常的生物体内的酶不都是可溶的?研磨是为了破碎细胞的。我觉得应该是通过加水——打碎胶体,把抗氧化剂全
2、都搞到水中(这个拜托查下)——分液——乙醇-氯仿沉淀(用来鉴别是带Mn还是CuZn)(不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰)——透析(去离子电泳用)乙醇-氯仿的浓度比酶的保存问题:测一下大宝pH应该可以作为参考,但是这个酶种类太多了,要点就是pH至少不能小于6,关于最适合pH是否也要测量?还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。还有一个小小的想法就是。这部分是1次做完还是两次做完?大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液(PH7.8,0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、
3、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL3个、500mL3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根成分:水,矿油(保湿),甘油(保湿),鲸蜡硬脂醇(稠化剂),聚二甲基硅氧烷(硅油),油,无视。月桂醇磷酸酯钾降低pH变成油,超氧岐化酶(SOD,抗氧化剂),人参根提取物(抗氧化剂),膜荚黄芪根提取物(抗氧化),甘油硬脂酸酯(稠化剂)油,EDTA二钠(螯合剂)干扰剂,香精,羟苯甲酯(防腐剂)微溶于水,羟苯丙酯(防腐剂)不溶于水,DMDM乙内酰脲(防腐剂)。含量0.1~0.6%E
4、DTA二钠:几乎不溶于乙醇、乙醚,其水溶液pH值约为5.3。用于络合金属离子和分离金属。干扰物,但是没有氧化性三、实验步骤:(1)SOD提取:取大宝sod蜜加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸缓冲液,研磨搅拌20分钟,使SOD充分溶解,6000rpm离心,弃去沉淀,得上清液。(留出1mL备用,准确量取剩余上清液体积,记录)(2)除杂蛋白:提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min,6000rpm离心15min去沉淀,得粗酶液。(取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)(3)SOD酶的沉淀分离: 剩余的粗酶液中加
5、入等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000rpm离心15min,得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液,溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min,取上清得到SOD酶液。取1mL备用,其余量取体积。(4)粗酶液活性测定:提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测,具体步骤如下。加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值。试剂/(mL)空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333样品000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三
6、酚00.20.20.20.2(5)溶液中可溶性蛋白含量测定: 分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度。提取液稀释:50×粗酶液稀释:20×酶液稀释:10×四、实验数据: 提取液粗酶液酶液总体积(ml) 对照管(OD1)提取液(OD2)粗酶液(OD2)酶液(OD2)420nm吸光值 提取液粗酶液酶液260nm吸光度值 280nm吸光度值 公式蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280-0.74A260)×稀释倍数蛋白质浓度(mg/
7、ml) 五、实验结果及数据处理:(1)酶活力单位提取液酶活力单位:=2(OD1-OD2)×5/0.1=粗酶液活力单位:=2(OD1-OD2)×5/0.1=酶液活力单位:=2(OD1-OD2)×5/0.1=(2)总活力提取液总活力U=活力单位×总体积=粗酶液总活力=活力单位×总体积=酶液总活力=活力单位×总体积=(3)比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=(4)纯化倍数粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液纯化倍数=酶液比活力
8、/提取液比活力=(5)回收率粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=
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