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1、猪巨细胞病毒PCR检测方法的建立及应用动物医学进展.201l,32(7):5-8ProgressinVeterinaryMedicine猪巨细胞病毒PCR检测方法的建立及应用刘红亮,朱玲,徐志文,王燕群,魏浩澈,郭万柱,赵玲(四川农业大学动物生物技术中心动物疫病与人类健康实验室,NJll农业大学,四川雅安625014)摘要:参考GenBank中收录的猪巨细胞病毒(PcMV)DNA聚合酶基因序列设计合成了一对引物,扩增目的片段为236bp.进行PCR检测方法的特异性,敏感性和重复性试验,建立了PCMV的PCR检测方法.
2、结果表明,该方法对模板的最低检测量为1.1pg,具有良好的特异性,敏感性和重复性.应用该法对猪同时感染PCMV和PRRSV相关性进行初步探究,36份PRRSV阳性病料中,PCMV检出率为63.89.该法可用于PCMV的l床发病诊断和流行病学监测等.关键词:猪巨细胞病毒;DNA聚合酶;PCR中图分类号:$852.659.1;Q789文献标识码:A文章编号:1007—5038(2011)07-0005—04猪巨细胞病毒(Porcinecytomegalovirus,PC—MV),属B疱疹病毒亚科.1955年DoneJTL
3、1在猪鼻甲骨黏膜黏液腺巨细胞中发现有大量嗜碱性核内包涵体,并首次从英格兰分离获得疱疹样病毒粒子.这是继伪狂犬病病毒之后发现的第2个猪疱疹病毒.因性质及其所致病变与人巨细胞病毒和豚鼠唾液腺病毒相似,而感染动物仅限于猪,故将该病毒称为猪巨细胞病毒[2].该病毒在世界范围内广泛分布,据EdingtonN[3]报道,早在1986年,英国已有9O9,6的猪群感染此病毒,其中大部分发生在管理良好,健康水平较高的农场.日本于1981年6月～11月,对45个都道府县的441例肉猪血清用间接荧光抗体法做了抗体调查,其中434例(98.
4、4)为阳性;1985年首次在日本分离到该病毒[4].韩国[5],北美和澳大利亚也有报道,其中美国发病率甚高,猪群的抗体阳性率为9O.国内关于猪巨细胞病毒PCR检测的报道甚少,对猪巨细胞病毒病的调查报道亦少,近年来仅见广西有此病毒感染的初步调查[6].本研究建立了猪巨细胞病毒的PCR检测方法,并用此法对四川I省部分地区(遂宁,乐山,眉山,简阳,雅安和德阳)采集样品进行检测,对本病毒在这些地区的流行情况进行了初步的调查,为今后该病毒感染的诊断和防控提供依据.1材料与方法1.1材料1.1.1病毒与病料PCV一2,PPV,P
5、RV,PRRSV均由四川农业大学动物生物技术中心分离保存.方法建立所用PCMV阳性病料由实验室保存;36份检测样品为2009年1月～9月采集自四JlI部分地区规模化猪场,经PRRSV检测为阳性的病料(肺,淋巴结).1.1.2主要试剂克隆宿主菌E.coliDH5a由四川农业大学动物生物技术中心提供;DNA抽提试剂盒(小量),胶回收试剂盒均购于博迈德公司;qDNA聚合酶,dNTP,1O×Reactionbuffer,MgC12,pMD19一T载体均购于宝生物工程(大连)有限公司.1.2方法1.2.1引物设计根据GenBa
6、nk公布PCMV基因序列(登录号AF268040),利用Primer5.0软件设计一对引物PCMV1/PCMV2:上游引物PCMV1:5'-CCTATGTTGGCACTGATACTTGAC一3;下游引物PCMV2:5'-CCCTGAAAATCAC—CGTCTGAGAGA_3,预扩增片段长236bp.通过计算机网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BL-AST/)分析,该对引物具有良好的特异性.引物由上海Invitrogen公司合成.1.2.2病料处理取解冻的待检病料3g,用灭菌的手术剪剪碎,加
7、入适量的生理盐水或PBS溶液(pH7.2)混匀,用灭菌研磨器充分研磨,再用1.5mLEppedorf管分装,反复冻融2次～3次,置一70℃保存备用.1.2.3病毒DNA模板的制备取病毒液和病料收稿日期:2010—12—17基金项目:"长江学者和创新团队发展计划"创新团队项目(IRT0848);IN川省教育厅重点实验室项目作者简介:刘红亮(1987一),男,四川安岳人,四川农业大学动物医学专业2008级2班本科学生.*通讯作者6动物医学进展2Ol1年第32卷第7期(总第2l7期)混悬液参照博迈德DNA小剂量抽提试剂盒说
8、明书进行病毒DNA的提取.1.2.4PCR扩增及产物的鉴定经反复筛选,最佳PCR扩增体系为10xPCRbuffer2.5L,dNTP(5mmol/L)1L,上下游引物(20/zmol/L)各0.5L,TaqDNA聚合酶(5U)0.5L,MgC12(25retool/L)2.0L,模板DNA2L,最后用无菌ddH.O补足至25L(阴性对照不加模板
