猪圆环病毒pcr检测方法的建立

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猪圆环病毒PCR检测方法的建立澎江廖种学2009年第4期猪圆环病毒PCR检测方法的建立王东方.,魏战勇.,崔保安,陈红英,郭小参,吕晓丽,管倩(1.河南农业关学牧医工程学院,河南郑州450002;2.河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州4500023.河南省动物疫病预防控制中心,河南郑州450o08)摘要:本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速,敏感,特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中可最低扩增到0.1ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV,PPV不能检出.可对病料,血清提取DNA进行检测,所有程序在5h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.关键词:PCR;检测;猪圆环病毒中图分类号:$859.81文献标识码:B文章编号:0528—9017(2009)04.0812.04猪圆环病毒(porcinecireovirus,PCV)是迄今为止发现的最小的一种脊椎动物病毒.根据PCV的致病性,抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两个基因型.PCV1广乏存在于猪体内及猪源代细胞系中,无致病性,不能引起细胞病变;PCV2具有致病性,主要引起一种新发现的传染病——断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyderome,PMWS).PMWS主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失.据报道,1991年PMWS首发于加拿大;目前世界其它地方普遍 有PMWS发生的报道.在我国,郎洪武等首次报道我国猪群存在PCV2感染以来,已陆续有二十几个省,自治区,直辖市报道有猪圆环病毒的感染一.对于该病诊断已有病毒分离,免疫荧光法,ELISA方法,免疫组化法等方法.这些方法操作烦琐,困难,经常受到条件制约,原位杂交等.目前广泛应用的PCR具有较高的敏感性和特异性.然而由于不同的引物之间差别较大,以及PCR扩增时各种因素的影响,使得PCR方法的特异性和敏感性各不相同,因此用于诊断时往往容易出现假阴性的结果.我们针对最常见的3种扩增PCV2的引物区域设计,比较了对引物的特异性和敏感性,优化了PCV2的PCR,诊断方法,建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法.这将有助于我国猪群PCV2疫情的监测,也能为控制该病的传播提供技术支持.1材料和方法1.1试验材料PCV2为中国农大杨汉春教授惠赠,猪细小病毒(PPV),伪狂犬(PRV)均为本室保存之毒种.PK15细胞(无PCV1污染)为本室保存.DMEM购自华美生物工程公司;葡萄糖胺购自Sigma公司;无菌胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司.pGEM—Teasy载体购自Promega公司,TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2,MarkerDL2000购自TaKaRa公司,异硫氰酸胍(GuSCN),饱和平衡酚,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),氯仿:异戊醇(24:1)等均购自上海Sangon有限公司. 1.2引物设计根据GenBank已发表的PCV2全基因序列AF027217,选择ORF1和ORF2设计3对引物pl/P2,P3/P4和P5/P6(表1).引物由上海生物工程公司合成.1.3病毒培养猪圆环病毒株及病毒接种无PCV1污染的50%长满的PK15细胞系单层细胞(用DMEM培养基培养,含10%小牛血清,100U青霉素,100g?mL收稿日期:2009.03.21基金项目:河南省杰出人才创新基金项目(0621002100)作者简介:王东方(1980一),男,河南新郑人,硕士,从事动物技术研究工作.注:崔保安系通讯作者,E—mail:baoancui@henau.edu.cn.王东方,等:猪圆环病毒PcR检测方法的建立田链霉素),37oC培养18h,当细胞增至80%时弃去培养液,用Hank's碱性盐溶液配制的300mmol?L葡萄糖胺37℃作用30min.换新鲜培养液,至细胞长满.细胞未出现任何特异性病变,仍保持良好状态,培养72h,用0.25%胰蛋白酶.EDTA消化,盲传3代后,取培养液一20℃室温冻融3次.一70℃保存.1.4PCV模板DN的制备参照分子克隆实验指南所述DNA提取方法进行.1.5猪圆环病毒PCR扩增PCV2PCR反应采用50反应体系,其组份如下:10×PCR缓冲液5tLL,MgC12浓度为4mmol?L～,NTPs浓度为200tLmol?L～,Taq酶1U, 引物P1,P2浓度为0.5p.mol?L～,模板5,最后用双蒸馏水补至50p.L.PCR扩增条件为:95oC预变性5min,按95℃1min,55cI=30s,72oC1min,共进行30个循环,然后72℃延伸10min,结束后用0.8%琼脂糖凝胶(含0.5ttg?mLI1的EB)电泳,观察结果.1.6反应条件的优化除选定的要优化的因素外,其他条件均按1.5步骤中不变,进行Mg2浓度的选择,引物浓度的选择,dNTPs最佳浓度的选择,复性温度的选择.改变变性温度和时间,退火温度时间,延伸时间以及循环数等条件.1.7PCR特异性测定分别提取PCV2,PRV和PPVDNA,正常PK一15细胞基因组DNA,进行PCR扩增,电泳,观察结果.取扩增产物回收扩增片段.1.8PCR敏感性测定用可见紫外分光光度计对提取的DNA进行260nnl,280nmOD测定,计算出其纯度和含量.将模板作10倍系列稀释,不同稀释度的模板DNA各取5,分别进行PCR扩增.1.9PCV2检测的应用将疑似病料(肝,肺,脾,肾等)研磨(与.PBS1:5)后,冻融3次,10000rmin离心10min,取上清液一2Oc【=保存备用.按参考文献提取病料中DNA作模板.用该方法对来自郑州,新乡,焦作,南阳等地养殖场的疑似病料进行检测.2结果和分析2.1扩增条件优化 确定了PCV2PCR反应采用50反应体系,其组份如下:10×PCR缓冲液5,MgC1:浓度为4mmol?L～,dNTPs浓度为200ttmol?L～,Taq酶1U,引物浓度均为0.5m01.L～,模板5,最后用双蒸馏水补至5O.确定了PI/P2,P3/P4,PS/P6的最佳循环扩增条件分别为:95cI=预变性5min,按95oC1min,56℃50s,72℃1min,共进行35个循环,然后72℃延伸10rain;95cI=预变性5min,按95℃1min,53℃45s,72cI=1min,共进行30个循环,然后72℃延伸10min;95℃预变性5min,按95qc1min,55℃30s,72oc45s,共进行30个循环,然后72℃延伸10min.在后续实验中均采用该相应条件.2.2特异性以PCV2,猪伪狂犬病和猪细小病毒感染的PK15细胞提取的细胞毒DNA为模板,分别用3对PCV2的引物进行PCR扩增.同时用阴性PK15细胞提取的DNA作为阴性对照.结果表明3对PCV2引物均可以从PCV2感染的细胞DNA中扩增出835,624和487bp大小的特异性条带.与预期条带太小一致,而PRV,PPV,阴性对照都没有条带(图1).并对3对PCR产物进行了回收酶切转化测序.证实扩增为PCV2序列.从而表明本研究所建立的PCR方法对PCV2是特异的.圃澎江.孝彳干学2009年第4期M1234M1234M12342000bp1000bp750bp500bp 250bp10ObpA为P1/P2引物;B为P3/P4引物;C为P5/P6引物;M为DL2000Marker;1为猪圆环病毒Ⅱ型核酸扩增结果2为猪细小病毒核酸扩增结果;3为猪伪狂犬病毒核酸扩增结果;4为正常PK—l5细胞图1不同引物的PCR特异性2.3敏感性以PCV2感染的PK15细胞提取的DNA为模板,用核酸测定仪确定其浓度为100ng?mL～.然后从100ngDNA开始按10倍递增稀释,再分别用3引2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp物进行PCR扩增.结果发现,引物对P1/P2和P3/P4可以检测出目的基因的最低DNA模板量比较低,难以分辨,引物对P5/P6的检测效果较好(图2).M12345678M12345678M123456782000bp1000bp750bp500bp250bp100bp20001000 7505oo2501OOA为PI/P2引物;B为P3/P4引物;C为P5/P6引物;M为DL2000Marker;1～8为感染猪圆环病毒的PK15细胞从100ng到10一ng图2不同引物的PCR敏感性2.4PCV2检测应用用该方法检测郑州,新乡,焦作,南阳养殖场的14份疑似PCV2的脾脏,肺脏,淋巴结病料,检测到阳性病料共7份,对部分PCR产物回收进行测序,将测序结果与GenBank中已发表的基因序列分别进行比较,与PCV2的同源性达96%.证明建立的PCR检测猪圆环病毒方法能够用于临床检测.检测电泳结果见图3.3小结和讨论本实验所设计的PCV2引物主要针对圆环病毒的2个ORFs:即ORF1和ORF2.ORF1是最大的阅读框,位于正链,是编码病毒的复制蛋白(rep),位于负链上ORF2编码病毒的结构蛋白(cap),与病毒的抗原性相关,便于猪圆环病毒的检测.而PCV2核苷酸序列同源性相比较,ORFI核苷酸序列咿∞∞如∞如∞OO752l,l咖王东方,等:猪圆环病毒PCR检测方法的建立圈000bp000bp 750bp500bp250bp100bpM为DL2000Marker;P为阳性对照;N为阴性对照;1～14为检测样品图3不同样品PCR扩增的结果同源性较高,而ORF2差异则很明显.所以设计了P1/P2位于ORF1,P3/P4,P5/P6位于0RF2.其3对都不能扩增PPV,PRV等病毒的核酸,具有良好的特异性,这与引物设计选择基因型高度保守区有关.在试验敏感性中,可以看到PS/P6可检测到0.1ng的总DNA浓度,敏感性最高.由此可见本方法敏感性高,特异性强,样本需要量少,应用于临床样品的检测效果良好.因此,本实验所建立的猪圆环病毒的诊断方法是可行的.PCR中各种反应成份的最佳量是PCR成功的关键,例如:Mg2,dNTP,DNA聚合酶.Mg2浓度是非常重要的,Mg2浓度与DNA聚合酶活性有很大相关.MS浓度过低时,酶活性显着降低;过高时,则会催化非特异性扩增.另外,PCR中反应成份如DNA聚合酶,dNTP等都是充足,但要适度,过量会抑制PCR反应.选择最佳的变性时间,退火时间,延伸时间以及循环数,不但能够提高PCR扩增效果,而且大大提高了PCR检测效率.自2006年夏季以来发生的猪高热病,该病突然起病,在猪群传染快速,不论品种,年龄,大小均发病,一般是断奶猪先病,架子猪,怀孕后期母猪,肥猪随后发生(有的猪场因传入途径不同发病过程也不一样).良种猪比本地猪或杂交猪发病率 和病死率均较高,进行了紧急免疫接种的猪场比不进行免疫的猪场死亡率高得多.其它动物如鸡,鸭,牛,羊,狗,猫不见发病.一些地方发生疫情后产生了恐慌,发现治疗效果不好,紧急出栏,急宰和外运,造成本病快速流行和远距离传播,使得这几年生猪出栏率急剧下降,猪肉价格疯狂升高,给我国养猪市场造成动荡不安,经济也造成重大损失.作者应用建立的猪圆环病毒PCR诊断检测技术从河南省各地区疑似感染有PMWS断奶仔猪病料及血清中检测出PCV2,这次从发病猪病料中检测到PCV2,但PCV2感染并非致死性疾病.因此,猪Ⅱ型圆环病毒感染可能处于从属地位(如混合感染,协同致病).但为今后进一步确珍和防治猪无名高热病提供新思路.参考文献:l1jAllanGM,MeehanB,ToddD,cta1.Novelporcinecireovirusfrompigswithwastingdiseasesyndromes[J].VetRec,1998,142:467—468.[2]AllanGM,PhenixKV,ToddD,eta1.Somebiologicalandphysico-chemicalpropertiesofporcinecircoviruslJJ.ZentralblVeterinarmed,1994,41(1):17—26.13jClarkEG.PostweaningmultisystemicwastingsyndromelJ].ProceedingoftheAmericanAssociationofSwinePractitioners,1997.28:499—501.[4]郎洪武,张广川,吴发权,等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技,2000,30(3):325.[5]周绪斌,张馨玉,许秀梅.我国猪圆环病毒2型的流行情况和分析[】].中国猪业,2007(5):37—41.[6]周绪斌,赵亚荣,等.猪圆环病毒病(PCVD)的流行动向 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