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第21卷4期中国病毒学21（4）：405-4072006年7月VIROLOGICASINICAJuly2006猪圆环病毒PCR检测方法的优化1,22**2122董志强，张志，李晓成，陈德坤，张燕霞，黄保续（1.西北农林科技大学,陕西杨凌712100；2.农业部动物检疫所,山东青岛266032）OptimizationofPCRfortheDetectionofPorcineCircovirus21,22**21DONGZhi-qiang，ZHANGZhi，LIXiao-cheng，CHENDe-kun，22ZHANGYan-xia，HUANGBao-xu(1.North-westSci-TechUniversityofAgricultureandForestry，Yangling712100,China；2.NationalAnimalQuarantineInstituteofMinistryofAgriculture,Qingdao266032,China)Abstract：ThreepairsofprimersP1/P2,P3/P4andP5/P6ofporcinecircovirus2weredesignedandsynthesizedtocomparethesensitivityandspecializationtoamplifyproductsof404bp,647bpand1773-6-5bp.OptimumdilutionofPK15cellgenomeinfectedwithPCV2wasachievedwith10ng,10ngtoyieldfromthethreepairsofprimers.ItwasalsoconfirmedthatP1/P2were68.4%successfulindetectingPCV2in57swinesamplesfromtheprovinceofFujian,Theotherprimers,P3/P4,P5/P6,wereonly57.9%and8.7%successful,respectively.Weconcludethatp1/p2istheoptimumprimerpairforsurveyingincidentsofPCV2inpigs.Keywords：Porcinecircovirus;PCR;Detection;Optimization关键词：圆环病毒；PCR；检测方法；优化中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1003-5125(2006)04-0405-03猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)为无囊为此，国内外开展了大量相关研究，建立了病膜的单股负链DNA病毒，是目前发现的最小的动毒分离、免疫荧光法、ELISA方法、免疫组化法[1]物病毒，大小约为17nm。PCV根据抗原性及基等方法，以及多种检测PCV2的PCR方法，如竞争[4~10]因组的不同可以分为PCV1和PCV2两种基因型，PCR、套式PCR和实时荧光PCR等。与传统PCV1分离自猪肾细胞系PK15，它不致病，能够方法相比，PCR具有较高的敏感性和特异性。在这在PK15中稳定存在而不形成细胞病变；PCV2对些PCR方法中，普通的PCR方法仍然是最常见和猪有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征最普遍运用的诊断方法。然而，由于不同的引物之(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和间差别较大，使得PCR方法的特异性和敏感性各不育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病。近年相同，因此用于诊断时往往容易出现假阴性的结来已成为严重危害我国养猪业的主要疾病之一。但果。本文针对最常见的三种扩增PCV2的引物区域迄今为止市场上还没有商品化疫苗和特效药物防设计和比较了3对引物的特异性和敏感性，优化了治该病，并且该病有时呈亚临床感染，所以做好该PCV2的PCR诊断方法，这将有助于我国猪群病的诊断显得尤为重要。PCV2疫情的监测，也能为控制该病的传播提供技PCV1基因组全长1759bp，PCV2基因组全术支持。[2，3]长1767bp或1768bp。序列比较表明PCV1与1材料和方法PCV2之间的核酸同源性只有68％，而不同PCV2[3]毒株之间的同源性均为96％以上。由于PCV1和1.1实验材料PCV2均不产生细胞病变，因此迫切需要建立一种试验所用的样品来自福建省57个猪场发病猪的肺既敏感又特异的检测PCV2的方法。脏和淋巴结。EcoliDH5α由本实验室保存，DNAZol收稿日期：2005-11-19修回日期：2006-02-16作者简介：董志强（1980-），男，硕士研究生，研究方向为分子病原学与免疫学。**通讯作者.Correspondinganthor.Tel:0532-85628464;Email:zhizh2001@126.com 406中国病毒学第21卷试剂盒购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶2结果与讨论（5U/uL）、10хBuffer、dNTP(25mmol/L)、PCR回收纯化试剂盒、pMD18-Ｔ载体、各种限制性内切2.1PCR扩增条件的筛选酶、DL-2000Marker均购自TakaRa公司。其他常规为获得三对引物最佳的扩增效果和最高的敏试剂均为分析纯。感性，我们分别对三对引物的扩增条件进行了摸索1.2引物设计和调整，即运用正交法，梯度性地改变变性温度和根据GenBank中发表的PCV2全基因序列时间、退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条AY556473，选择不同的位置设计三对不同引物件，最终确定了P1/P2、P3/P4和P5/P6的最佳循P1/P2、P3/P4和P5/P6，对应于第401-383/1717-环扩增条件，分别为95℃1min，58℃30s，72℃1736，92-113/717-738h和441-467/447-420位碱基，1min，30个循环；94℃45s，53℃1min，72℃1min，分别扩增404bp、647bp和1773bp等3条大小不同30个循环；94℃5min；94℃1min，56℃min，72的PCV2特异性序列。引物由上海生物工程公司合℃2min，35个循环。在后续试验中均采用该相应成。条件。1.3模板的制备2.2特异性试验猪的肺脏和淋巴结，取50mg剪碎后加入4倍以PCV2、PCV1、猪瘟（CSFV）、猪繁殖与呼体积的10%PBS研磨匀浆。匀浆液转移至1.5mL离吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）心管中，反复冻融3次后，10000×g离心5min，取和猪细小病毒（PPV）感染的PK15细胞提取的阳100μL上清液（细胞毒）于1.5mL的离心管中，加入性细胞毒DNA为模板，分别用三对PCV2的引物1mLDNAZol，倒置混匀，室温放置3min，10000×g进行PCR扩增。同时用正常健康猪和阴性PK15细离心10min；上清转移至另一离心管中，加入500mL胞提取的DNA基因组作为阴性对照。结果发现用无水乙醇，颠倒混匀，室温放置5min，6000×g离三对PCV2引物均可以从PCV2感染的细胞DNA心5min；沉淀用1mL75%的酒精洗涤两次；最后用中扩增出404bp、647bp和1773bp大小的特异性条40μL的8mmol/LNaOH溶解，－20℃保存备用。带（图略），与预期条带大小一致，而CSFV、PCV1、1.4病料的PCR扩增PRRS、PRV、PPV、正常健康猪和阴性对照都没有PCR反应体系为25μL体积，反应体系中含10条带。这表明本研究所建立的PCR方法对PCV2хBuffer2.5μL，dNTP2μL，上游引物、下游引物各是特异的。0.5μL，rTaq酶0.2μL，模板3μL，用灭菌超纯水补2.3敏感性试验足25μL。PCR扩增条件为：95℃变性3min后，按以PCV2感染的PK15细胞提取的DNA为模95℃1min，58℃30s，72℃1min，共进行30个循板，用核酸测定仪确定其浓度为100ng/mL,然后从－9环。然后72℃延伸10min，结束后用1%琼脂糖凝100ngDNA开始按10倍递增稀释至10，再分胶电泳电泳观察结果。别用三对引物进行PCR扩增，结果发现，引物对1.5特异性试验、敏感性试验及样品检测P1/P2和P3/P4可以检测出目的基因的最低DNA模-6-5分别调整上述PCR反应中的PCR扩增条件，板量分别为10ng和10ng，引物对P5/P6的检测-5寻找每对引物的最合适条件，然后以我国福建省57下限也可以达到10ng，但已经非常难以分辨。所份病料为例进行特异性和敏感性试验。以引物对P1/P2的效果最好。详见图1。图1不同引物的PCR敏感性试验Fig.1SensitivitytestofPCRbydifferentprimers-6A:P1/P2primers.B:P3/P4primers.C:P5/P6primers.M,Marker;1-9,100ngto10ngofPK15CellDNAinfectedwithPCV2 董志强,等.猪圆环病毒PCR检测方法的优化4072.4PCR引物对在样品检测中的应用和分析syndromeinpigs[J].JVirol,1998,72:5262-5267.分别用三对引物对我国福建省的57份猪淋巴[4]LarochelleR,BielanskiA,MidlerP,etal.PCRdetectionand结等病料进行PCV2的检测，结果用引物对p1/p2evidenceofsheddingofporcinecircovirustype2inboarsemen[J].J检测的阳性率为68.4%，用引物对p3/p4检测的阳ClinMicrobiol,2000,38:4629-4632.性率为57.9%，用引物对p5/p6检测的阳性率为[5]LarochelleR,AntayaM,MorinM,etal.1999.Typingofporcine8.7%。这表明引物对P1/P2是这三对引物中敏感性circovirusinclinicalspecimensbymultiplexPCR[J].JVirol最高的一对引物，这一结果与我们2.3中的结果差Methods,80:69-75.别较大。这可能与敏感性试验中样品的纯度较高有[6]McNeillvF,McNairI,0'ConnorM,etal.Evaluationofaporcine关，而实际检测样品中的影响因素较多，所以扩增circovirustype2-specificantigen-captureenzyme-linkedimmun-片段越大的引物越难以扩增相应片段，导致扩增的osorbentassayforthediagnosisofpost-weaningmultisystemic敏感性下降，以致引物对P5/P6的检出率只有8.7%。wastingsyndromeinpigs:comparisonwithvirusisolation,immuno-从这个结果可以看出，引物对P1/P2确实是三者中histochemistry,andthepolymerasechainreaction[J].JVetDiagn最优化的引物对，非常适用于生产实践。由于条件Tnvest,2002,14(2):l06-112.所限，优化得到的这对引物可能不是最好的扩增[7]NawagitgulP,HarmsPA,MorozovI,etal.ModifiedindirectPCV2的引物，但该引物对确实能大大提高了PCRporcinecircovirus(PCV)type2-basedandrecombinantcapsid的诊断能力，为大规模的进行PCV2的流行病学调protein(ORF2)-basedenzyme-linkedinnmunosorbentassaysfor查和监测提供了理论依据和技术支持。detectionofantibodiestoPCV[J].ClinDiagnLabImmunol,2002,9同时对福建省猪样品的监测结果也表明，(1):33-40.PCV2在该省流行非常严重，阳性率至少高达[8]LiuQ,WangL,WillsonP,etal.Quantitative,competitivePCR68.4%，各养猪场都应做好PCV2的预防和控制。analysisofporcinecircovirusDNAinserumfrompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J].JClinMicro,2000,References38(9):3474-3477.[1]TischerI,MieldsW,WolffD,etal.Studiesonepidemiologyand[9]KimJ,ChaeC.Acomparisonofvirusisolation,polymerasechainpathogenicityofporcinecircovirus[J].ArchVirol,1991(3-4):reaction,immunohistochemistry,andinsituhybridizationforthe271-276.detectionofporcinecircovirus2andporcineparvovirusinexperimentallyandnaturallycoinfectedpigs[J].JVetDiagnInvest,[2]AllanGM,McNeillyF,KennedyS,etal.Isolationofporcine2004,16(1):45-50.circovirus-likevirusesfrompigwithawastingdiseaseintheUnited[10]HuangC,HungJJ,WuCY,etal.MultiplexPCRforrapiddetectionstatesofAmericanandEurope[J].JVetDiagenInvest,1998,10:ofpseudorabiesvirus,porcineparvovirusandporcinecircoviruses3-10.[J].VetMicrobiol,2004,14;101(3):209-14.[3]HamelAL,LinLL,NayarGP.Nucleotidesequenceoftheporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwasting
