pcr试剂盒的选用和质检

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1、临床PCR试剂盒的选用和质检卫生部临床检验中心李金明PCR或RT-PCR试剂盒的组成核酸提取试剂核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）影响PCR试剂盒质量的因素内在因素:原材料、核酸提取方法、方法学设计影响PCR试剂盒质量的因素：扩增所需的原材料寡核苷酸引物和探针缓冲液和dNTP聚合酶、逆转录酶等PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase生物素标记的引物和或和寡核苷酸引物和探针其对试剂盒质量的影响首先

2、是纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断，如‹2.0，则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。是否有污染。结合特异性（浓度）dNTP和缓冲液dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）的浓度缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg＋＋（或用于rTth的Mn＋＋）的浓度以及pH等逆转录酶、DNA聚合酶酶的浓度酶的活性核酸扩增方法PCRRT－PCR转录依赖的扩增（TMA）连接酶链反应（LCR）链替代扩增（SDA）等影响PCR试剂盒质量的因素：核酸提取核酸提

3、取的有效性核酸提取的简便性影响PCR试剂盒质量的因素：产物检测杂交固相特异探针及其标记物影响PCR试剂盒质量的因素内在因素:原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。PCR试剂盒的分类定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和TaqM

4、an等）定量测定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor荧光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。PCR试剂盒的选用原则参考试剂生产厂家的信息广告参考同行对有关试剂盒的使用效果参考有关机构的综合评价根据使用目的根据所在实验室的技术特点根据所在医院患者的承受能力PCR试剂盒的质检外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。PCR试剂盒的质检(定性测定)性能质检采用血清（样本）盘（Panel）质检：PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、阳性样本

5、、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式灵敏度（％）＝(a/a+c)100%特异性（％）＝(d/b+d)100%符合率（％）＝(a+d/a+b+c+d)100%PCR试剂盒的质检(定量测定)样本：已知浓度的高、中、低三种浓度质控物。质检内容：测定的重复性

6、测定范围抗干扰能力技术验收依据：《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字2002第8号技术验收内容实验室设置和设备设施和环境人员设备管理检测方法标本管理记录报告质量控制抱怨等十章共三十八条实验室设置和设备本章共七条。实验室分区：规范化分区、明确的识别标记防污染：空气流向、中央空调、各区间的封闭性各区仪器设备物品配备：充分性、科学性、专用性（标识）“生物安全柜”“可移动紫外灯”“加样器”设施和环境本章包括五条；实验室设施、工作区域、能源、照明等；环境和实验条件控制设施：温湿度计、不间断或稳压电源等；实验室

7、进出的限制和控制：人员进入控制标识、生物传染危险性标识实验室“内务管理”（如人员流动、清洁等）制度和相应设施；废弃血清处理、生物防护等措施和相应设施设施和环境需注意的问题清洁程序或制度清洁用具的专用、清洁工作的单一流向、清洁方法的具体性生物防护及废弃血清处理对工作人员的保护和对环境的保护锐器使用规则生物传染危险性废弃物出实验室前预处理人员本章包括三条。人员数量足够；有培训上岗证培训计划：室内的定期培训（记录）人员技术（资格、培训、技能）档案。设备管理（1）本章包括三条。主要仪器设备应得到正确维护，应有设备维护程序文件；以及维护的记录加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等

8、设备应有校