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1、不同时间血液灌流对脓毒症兔血IL-6及TNF-α水平影响[摘要]目的:通过动态检测脓毒症兔血IL-6及TNF-α水平变化,探讨行血液灌流最佳时机。方法：将18只新西兰大白兔随机分成6组,通过盲肠结扎穿孔法制作脓毒症模型,分别在术后3、6、12、24、48h行单次血液灌流,同时设立空灌流组(对照组),并均在手术前，术后3、6、9、12、24、48h动态检测血清中IL-6及TNF-α水平,记录各组兔子的生存时间。结果：术后12h行血液灌流组血IL-6平均水平最低(854.2pg•ml-1),生存时间最长(73.3h),P1.2方法1.2.1动物模
2、型制备参照文献［4］的兔盲肠结扎穿孔法(CLP)制备兔脓毒症模型。自耳缘静脉注入1.5%戊巴比妥钠溶液2ml•kg-1。腹正中线切开约7cm,打开腹腔,在阑尾和盲肠交界处用丝线结扎,并将阑尾血管结扎。用直径2.5mm针头,对穿阑尾3次。检查无活动出血点后回纳盲肠,缝合腹壁。术后维持麻醉状态并继续进行股动静脉置管术。91.2.2股动静脉置管触及右腹股沟动脉波动最明显处后,沿腹股沟切开皮肤约3.5cm,暴露并分离股动、静脉约3cm,下穿双丝线。股动脉近心端予动脉夹夹闭后,持预先充满肝素的医用留置针自远心端插入动脉,退针芯,松开动脉夹。结扎及固定动
3、脉前,于动脉和丝线间放入橡胶小软垫(用橡胶手套边缘剪出约1cm做成,术前碘伏消毒)以防止结扎后右下肢缺血性坏死。股静脉穿刺方法同样。缝合皮肤,盖纱布,外露肝素帽及部分导管,以待行血液灌流用。留置针定时用肝素冲管。1.2.3分组把18只实验兔随机分为6组,每只均按上述依次行盲肠结扎穿孔术(CLP)及动静脉置管,每组3只。6组分别为手术后3h灌流组(术后3h组,即盲肠结扎穿孔手术腹壁肌层缝合完毕开始算起3h后行单次血液灌流,以下分组类似)、术后6h组、术后12h组、术后24h组、术后48h组及空灌流组(即对照组或空灌组,术后3h仅行空灌流,灌流器内无吸附剂,
4、仅以肝素生理盐水充满)。每组均按所在组对应术后时间行血液灌流。1.2.4血液灌流兔灌流罐用20ml注射器制作,内含HA330灌流罐湿树脂15ml。对照组空灌流器注射器内不含树脂。管路连接为：输血器针头(插入股动脉端留置针肝素帽)→输血器软管359cm→自制注射器灌流器→输血器软管10cm→兰格16号软管15cm→输血器软管15cm→输血器针头(插入股静脉端肝素帽)。灌流前均已行钴-60辐照消毒,剂量20KGy。用肝素盐水［含肝素30mg•(250ml)-1］预冲管路并在灌流前10min静脉推注肝素8mg•kg-1,达肝素化。灌流时
5、间2h,速度为5ml•min-1。1.2.5观察和检测指标、采集时间1.2.5.1观察指标术后兔均固定于手术台上直至死亡。手术间温度控制在25℃左右,每日补充液体量按70ml•kg-1(生理盐水∶10%葡萄糖注射液为1∶3),由耳缘静脉或股静脉留置针缓慢滴入,但采血前或灌流前0.5h暂停补液,以免影响结果。如果兔醒后骚动较剧烈可于静脉端留置针酌情缓慢滴入少量戊巴比妥钠镇静。每日定时观察兔体温、心率、呼吸、精神状态,并记录生存时间(起点为做完CLP时间,终点为兔死亡时间)。1.2.5.2检测指标、采集时间各实验兔均于盲肠结扎穿孔手术
6、前、术后3h、术后6h、术后9h、术后12h、术后24h、术后48h一共7个时间点经过兔耳缘静脉采血,每次2ml。均通过ELISA法试剂盒集中检测IL-6及TNF-α水平。每只兔均于术前及术后24h分别行外周血白细胞计数；并在术后24h无菌操作下采集静脉血19ml,注入牛肉汤中37℃孵箱中增菌,牛肉汤浑浊后转血平皿,长出单个菌落后进行细菌鉴定。手术前后白细胞计数有明显升高或降低、血培养有致病菌生长的实验兔方可认为脓毒症造模有效；若否,则均需重新再随机抽取实验兔重复实验至造模成功为止。1.3统计学处理计量资料以±s表示,采用统计学软件SPSS13.0,检验
7、水准α=0.05。生存时间用生存分析Kaplan-Meier法。IL-6及TNF-α水平均用重复测量方差分析,并行两者相关性分析。2结果2.1生存结果结扎穿孔术后约24h兔开始出现精神倦怠，呼吸、心率逐渐增快等症状,均于术后48h至80h间死亡。手术前后白细胞计数均有明显变化,血细菌培养结果均有大肠杆菌生长。3h组生存时间为（49.333±0.882）h；6h组为（51.333±1.856）h；12h组为（73.333±3.528）h；24h组为（64.667±4.667）h；48h组为（58.000±3.055）h；空灌流组为(50.667±1.202
8、)h。总体间差异有统计学意义（P=0.001）;3h组与12h组、24h组、48
