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1、Tricine SDS-PAGE实用方案Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。一、试剂配配制：1．LowBisacrylamide（49.5%T,3%C）Acylamide48.0gBis1.5gWatermakeupto100ml2.HighBisacrylamide(49.5%T,6%C)Acrylamide46.5gBis3.0gWatermakeupto100ml3.GelBuffer(3MTris/cl,PH8.45,0.3%SDS)SDS0.3gTris36.4g
2、Watermakeupto100mlPHto8.45withHCL注:3MTris配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2MTris,配方如下:Tris36.4gSDS0.3gWatermakeupto150ml4.Anode(Lower)buffer阳极缓冲液(0.2MTris/cl,PH8.9)Tris12.11gWatermakeupto500mlPHto8.9withHCL5.Cathode(Upper)buffer阴极缓冲液(0.1MTris/cl,0.1MTricine,0.1%SDS,PH8.25)
3、Tris6.06gTricine8.96gSDS0.5gWatermakeupto500ml注:不用调PH值6.4×TricineSDSSamplebuffer4×上样缓冲液(Finalconcentration:0.05MTris/cl,4%SDS,12%glycerol,200mMDTT,0.01%CommasieG250)8×Tris.cl/SDSPH6.82mlGlycerol4.8mlSDS1.6gCommasieBlueG2504mgWatermakeupto10ml注:8×Tris.cl/SDSP
4、H6.8配方Tris6.05gSDS0.4gWatermakeupto100mlPHto6.8withHCL二、胶的配制1.16.5%T6%Cseparatinggel30ml49.5%T6%C10mlGelbuffer15mlGlycerol3.2mlWater1.8ml2.10%T3%Cspacergel30ml49.5%T3%C6.1mlGelbuffer15mlWater8.9ml3.4%T3%Cstackinggel12.5ml49.5%T3%C1mlGelbuffer4.65mlWater6.85m
5、l注:用Bio-Rad系统,0.75mm的胶,separatinggel配3ml,加2.5ml;Spacergel配1ml,加0.7ml;Stackinggel配1.25ml.灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED.胶配制的通用配方:三、电泳参数及染色脱色1.用Bio-Radmini电泳装置进行电泳.30V电泳1hr,100V至电泳结束2.固定,染色及脱色:小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后,有时需要固定20min(固定液:0.5%戊二醛,30%乙醇),再进行染色20-30min
6、(染色液:50%甲醇,10%乙醇,0.2%G-250),在脱色液(45%甲醇,10%冰醋酸)脱色20-30min;脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.四、电泳示例照片小分子该选择用tricine-SDS-PAGE.protocol上写着thecommonroleofglycerolinSDSgelsistoincreasethedensityofsolutionsandtofacilitategelcasting;ithasnoobiouseffectonproteinseparationItried25%T
7、ricinegelfor3KDpeptide,looksgood.GoodLuck!哦，我自己经常做2x多的分子，用的是15%的gel，效果很好的。1xKD的用16%的PAGE就应该可以了。你可以试一试Tricine-SDS-PAGE，16%的分离胶，6%的浓缩胶。分离胶单体母液：46.5g丙烯酰胺+3g双叉丙烯酰胺，双蒸水溶解定容到100ml凝胶浓度49.5%，交联度6%浓缩胶单体母液：48g丙烯酰胺+1.5g双叉丙烯酰胺，双蒸水溶解定容到100ml凝胶浓度49.5%，交联度3%配方：分离胶母液3.3ml+凝
8、胶缓冲液3.3ml+30%甘油2.4ml+双蒸水1.0ml+10%AP45μl+TEMED4.5μl浓缩胶母液0.3ml+凝胶缓冲液0.93ml+双蒸水1.27ml+10%AP25μl+TEMED2.5μl分离范围1～100KD，最佳分离范围2～70KD初始电压30，等样品进入分离胶电压升至80，最终电压可升至120其实12kD的蛋白，15％的也就可以了，20％的也没问题如果你的表达量
