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1、硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核效应的研究5硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核效应的研究前言：如今环境重金属污染已引起广泛关注。蚕豆根尖细胞在分裂期间对外界环境反应敏感,造成染色体畸变、微核等分裂异常现象,其变异率与污染物种类及浓度相关,因此可利用蚕豆根尖分裂细胞的微核率测知污染物的环境毒理效应。蚕豆(Viciafaba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验。本实验利用
2、蚕豆根尖微核技术,研究了不同浓度的硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核诱变的影响,从而从细胞的水平上来研究重金属的毒害机理,为进一步评价环境质量具有重要意义。1概述如今环境重金属污染已引起广泛关注。植物对重金属的吸收、积累及重金属对植物的生理生化特性的影响已有较多报道,而其对染色体行为的影响少见报道。蚕豆根尖细胞在分裂期间对外界环境反应敏感,造成染色体畸变、微核等分裂异常现象,其变异率与污染物种类及浓度相关,因此可利用蚕豆根尖分裂细胞的微核率测知污染物的环境毒理效应。随着微核形成机制的阐明以及检测手段和实验技
3、术的不断改进和完善,蚕豆根尖微核试验在重金应用。本实验利用蚕豆根尖微核技术,研究了不同浓度的重金属对蚕豆根尖细胞微核诱变的影响,从而从细胞的水平上来研究重金属的毒害机理,为进一步评价环境质量具有重要意义。2材料和方法2.1实验材料A．实验材料：蚕豆种子B.实验器材[1]光学显微镜[2]试管(10ml)×2[3]蚕豆发芽盒[4]其它：镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。C.试剂[1]硫酸铜溶液：1g/L、5g/L、10g/L[2]卡诺氏固定液：将乙醇和冰醋酸以3：1(V/V)混和配制；[3]水解分
4、离液：盐酸与95%酒精1：1混合；[4]改良苯酚品红染液母液：将3.0g碱性品红溶解在100ml70%乙醇中，以1:9的比例将其与5%苯酚溶液混和，即得到改良苯酚品红染液母液。[5]苯酚品红染液：将45ml母液，6ml冰醋酸，6ml37%甲醛混合均匀。[6]改良苯酚品红染液：20ml苯酚品红染液加入180ml45%乙酸和3.6g山梨醇，静置两周后使用。52.2实验方法2.2.1蚕豆种子的浸种与催芽浸种准备好的蚕豆种子，按需要量放入盛有自来水的烧杯中，置于25摄氏度的温箱中预热。如室温超过25度，即
5、可在室温下进行浸种催芽（约24小时）。催芽待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘或烧杯中，保持湿度，在25摄氏度的温箱中催芽12h-24h，待种子出生根露出2mm-3mm时，选取发芽良好的种子，放入铺有薄薄一层的湿脱脂棉的解剖盘中，仍置于25摄氏度温箱中继续催芽，注意保持湿度。再经过36h-48h，种子大部分初生根长至1.5—3.0cm，根尖发育良好，这时就可用于监测水样或检测药物溶液诱变效应。2.2.2染毒与修复培养每组选择6-8粒发芽良好的蚕豆种子，用配制好的不同浓度的硫酸铜溶液（1g/L、5g
6、/L、10g/L）染毒处理6小时后（使根尖完全浸入处理水样中，）取出后用蒸馏水冲洗（3次,每次2-3分钟），并移至蒸馏水中修复培养22—26小时（蒸馏水浸住根尖）。2.2.3材料固定借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。吸取约5ml卡诺氏固定液于10ml试管中，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0c
7、m的幼根，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24h，固定液的用量为材料体积的15倍以上。2.2.4水解分离水解分离的作用是去除细胞内未固定的蛋白质,同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。用镊子取固定好的蚕豆根尖，放在试管内，加水解分离液2ml，室温下处理8-20min，倒去水解分离液，再加入固定液2ml，软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄轻压能压碎为佳。2.2.5染色和压片切取蚕豆根尖分生组织放在载玻片上纵横切成几
8、段，放在载玻片上，以十字压片法覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压使细胞充分分散，注意不要移动玻片，然后分开两玻片，各滴上1-2滴染液，染色20-30min后加上盖玻片，注意不要产生气泡，最后用吸水纸吸去多余染液。52.2.6镜检在40×10倍镜显微镜下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形、椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。3结果与讨论3.1在显微镜下,1g/LCuSO4溶液下可以观察到微核,而5g/L和10g/L的CuSO4溶液下
