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1、周围环境微生物检测和啤酒酸奶制备一、实验内容与目的1.稀释法分离土壤中微生物；2.观察周围环境中微生物；3.掌握微生物的分离、纯化；4.认识微生物存在的普遍性，理解无菌操作原理；5.了解固定化细胞技术的方法和意义；6.了解酵母发酵产生啤酒的过程；7.学习酸奶制作方法；8.了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread pla
2、te method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法 （stesak plate method）。 本次实验采取的是平板划线分离法和稀释涂布平板法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯
3、培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。现发酵常采用固定化技术，即：将生物酶或细胞固定在一定的基质上,从而提供酶或细胞的利用效率。采用固定化技术生产啤酒，具有的优势有：①固定化细胞能重复使用；②发酵后菌体与发酵液易于分离；③后处理工艺简单,成本低；④可连续发酵,过程自动化。而传统发酵法中，酵母细胞只发酵一次即弃去菌体。固定化技术中的包埋法，即：将微生物细胞均匀的包埋在水
4、不溶性载体的紧密结构中,细胞不易漏出。优势是：制定固定化细胞时,细胞和载体不起任何反应,细胞处于最佳生理状态；固定化细胞有载体为屏障,可避免外界不利因素的影响。三、实验材料与仪器（一）周围环境微生物检测1.菌源：土样10g；2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基12个；3.实验试剂：0.9%无菌生理盐水，99ml生理盐水,每瓶加约20粒玻璃珠；4.实验仪器：培养箱、灭菌锅等。（一）啤酒酸奶制作1.实验材料：啤酒酵母，酸奶酵母；2.发酵培养基：100ml麦芽汁(8%~10%)，新鲜酸奶；3.实验试剂：2.5%海藻酸钠溶液5ml,灭菌
5、；1.5%CaCl250ml,灭菌；0.9%无菌生理盐水,50ml；4.实验用具：无菌滴管，无菌玻璃棒，无菌封口膜封好的100ml三角瓶。一、操作步骤（一）稀释法分离土壤中微生物1.采土样选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入烧杯,带回实验室。2.制备土壤稀释液在实验室外选取土样1.0g，加入烧杯后，加入99mL无菌水，配成西施一百倍的土壤稀释液。震荡5min成为土壤悬液，即10-2稀释。再进行精确稀释，稀释100倍，制成10-4土壤稀释液。3.涂布用无菌吸头，吸取10-4浓度土壤稀释液100ul，
6、较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃棒涂涂匀。每人做一块平板。4.土壤微生物培养将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于320C温箱中培养24h；统计所长出的菌落数。5.菌落计数遇到有较大片菌苔生长时,弃用。若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半分布均匀,将此一半计数乘于2。（二）观察周围环境中微生物1.选择培养皿选择先前制备的4个培养皿剩下的三个，可每个中划线标示以后培养多个试样，或只培养一个试样。2.接种微生物至培养基2.1手指涂抹（用力一致）;2.2毛巾,旧纸币拖动;2.3头发压紧;2.4无菌接种环分别
7、沾一环自来水和河水划线或取0.1ml进行涂布；2.5用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线；2.6空气中10min;2.7酒精灯火焰边打开皿盖1min；2.8咳嗽或打喷嚏；2.9稍稍打开嘴唇压在培养基上;1.1水杯水、矿泉水、豆浆等涂板观察。2.培养箱培养倒置32℃培养箱里培养24小时观察结果。（一）啤酒发酵1.菌体培养将培养24h的新鲜斜面菌种,接种于三角瓶中培养。2.细胞固定化在5mL海藻酸钠溶液中,加入2ml预热至35oC的酵母培养液,混合均匀,以无菌滴管吸取混合液,滴管口离液面5cm以上,缓慢而稳定滴加到CaCl2溶液
8、中,即可得到直径约3mm左右的凝胶珠;全部滴入.钙化30min。（二）酸奶发酵选择一杯新鲜的已加入酸奶酵母的鲜奶，标记上自己的名字，放入恒温箱中发酵，在10多小时后，进行熟化。为期一天即可喝到鲜美的酸奶。一、观察实验结果与分析讨论1.原始实验数据记录与分析（图片）1.1三个组员的手机外壳菌种培养由培养结
