时间分辨荧光技术TRFIA技术培训资料

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1、广州医学院免疫检验教研室冯健明讲师时间分辨荧光技术一、回顾标记免疫学发展标记免疫技术的检测水平放射免疫（精度：10-12mol/L）酶联免疫（精度：10-9mol/L）化学发光（精度：10-15mol/L）电化学发光（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）放射性免疫分析法（RIA）应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。问题放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害125I的半衰期短而导致

2、其试剂有效期短被标记物的稳定性差操作繁琐，费时无法保存备用酶免疫分析法（ELISA）应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害试剂有效期较长曾经一度被认为是取代放免的检测手段问题灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好化学发光免疫分析法（chemiluminescentimmunoassay）应用单个样本检测速度快，适合做急诊灵敏度较高自动化程度高分类：以丫啶酯直接标记以HRP标记，鲁米诺为发光底物—Amerlite系统以AP(碱性磷酸酶)为标记物，AMPPD为发

3、光底物问题样品不能重复检测本底较高仪器故障率较高试剂稳定性较差检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足非开放性试剂；试剂价格高电化学发光免疫分析法（ECL）应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法基本原理：根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽以罗氏为代表缺点非开放性试剂系统、不能做科研试剂价格过高二、时间分辨荧光技术（Time-ResolvedFluorescence）时间分辨荧光发展史1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，1

4、989年该技术获诺贝尔化学奖提名。90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段时间分辨免疫荧光技术的定义用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离—增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，

5、达到定量分析的目的TRF分析原理图（1）加样本微量反应孔包被好的抗体振荡、洗板待测项目（抗原）加入Eu标VVEu标记物轻链螯合剂Eu重链振荡、洗板V加入解离增强液仪器检测标记物为稀土金属---镧系元素铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb)镧系元素荧光特点：1、荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0TRF分析原理图

6、（2）标记物为稀土金属---镧系元素2、Stokes位移大（大约290nm）铕：激发光340nm、发射光613nm荧光素的Stokes位移为280nm3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615±5nm）4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍巨大Stokes位移发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离TRFIA为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发光分离零背景、高特异性高灵敏度解离-增强荧光性大大提高稳定的

7、荧光螯合物线性范围宽高灵敏度原子标记标记位点多，可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次可两点定标多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目灵敏度更高，检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书试剂DELFIA（WALLC）Immulite（DPC化学发光）ACS-180(拜尔）AFP0.1-1000IU/ml0.2-300IU/ml1.0-1000IU/mlCEA0.1-500ng/ml0.2-500ng/ml0.5-100n

8、g/mlHCG0.5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/LTSH0.005-100μU/ml0.002-75μU/ml0.03-150μU/mlFSH0.05-256mU/ml0.1-170mU/ml0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L无0.1-40ng/mlProlactin