抗cd20单克隆抗体adcc生物学活性方法的建立

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1、抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立王兰6，刘春雨6，郭玮，于传飞，张峰，王文波，李萌，高凯*中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，北京1000506：并列第一作者；*通讯作者【摘要】目的建立抗CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性检测方法。方法利用Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIα细胞系作为效应细胞，WIL2-S细胞系作为靶细胞，通过荧光素酶检测系统（BioGloTMLuciferaseAssaysystem）进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测，并对试验条件进行优化及方法学验证。结果抗CD20单抗在该方法中存在量效关系，且符合四参数方程式

2、：y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D。方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞，抗体稀释浓度为18000ng/ml，1:5倍的稀释倍数，效靶比为6:1，诱导时间为6h。该方法具有良好的专属性，8次独立试验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验；4个不同稀释组回收率样本经3次测定，相对效价分别为44.39±3.93、72.74±2.78、128.28±7.01以及168.19±2.70，变异系数均小于10%，回收率分别为88.78±7.85、96.99±3.70、102.63±5.61以及112.12±1.80。结论首次成功建立抗CD20单抗ADCC生物学活性的转基因细胞

3、检测方法，该方法专属性强、重复性好，准确性高，可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。【关键词】抗CD20单克隆抗体；ADCC；生物学活性；荧光素酶检测系统CD20抗原是分子量为35kD的非糖基化跨膜蛋白，CD20作为B细胞表面特有的分化抗原，在95%以上的B细胞淋巴瘤细胞膜上高密度表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其它正常组织中不表达。且CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，是B淋巴细胞瘤免疫靶向治疗的理想靶点。目前抗CD20单克隆抗体产品已显示良好的临床疗效并得到广泛应用。大量研究表明，CD20单抗与B细胞淋巴瘤表面抗原结合后,主要通过补体依赖的

4、细胞毒作用（CDC）以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）将肿瘤细胞溶解。ADCC基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（编号2014ZX09304311-001、2012ZX09304010）通讯作者：高凯，E-mail:gaokai@nifdc.org.cn效应是CD20单抗杀伤肿瘤靶细胞重要机制之一。CD20单抗与B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20抗原结合后，导致抗体Fc段构象改变而并与细胞毒效应细胞表面上表达的FcRγIIIa结合,从而激发NK、巨噬细胞等效应细胞的杀伤活性，释放穿孔素和颗粒酶，对肿瘤靶细胞进行杀伤。目前以CD20抗原为靶点的嵌合、人源化及其它各

5、种突变体抗体药物质量研究中，其生物学活性主要采用的是CDC活性测定。但在抗CD20单抗的另一作用机制ADCC生物学活性领域鲜有问津。传统的ADCC测活方法多为基于新鲜制备的外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）或者NK细胞作为效应细胞的杀伤试验，存在着变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷，因此迫切需要研究建立评价ADCC生物学活性的新方法。本文以荧光素酶报告基因检测系统为平台，利用改造后的Jurkat细胞系，在国内首次建立了灵敏、快速的ADCC生物学活性检测方法。1.材料与方法1.1细胞系WIL2-S细胞系（购自ATCC）；J

6、urkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞系（购自Promega公司）。该细胞系是稳定转染FcγRIIIa受体以及NFAT（nuclearfactorofactivatedT-cells）反应元件质粒的急性T细胞白血病细胞系细胞系，FcγRIIIa受体是介导ADCC生物学活性的必要分子，通过单抗的Fc段将效应细胞与靶细胞连接起来，激活NFAT通路，启动荧光素酶报告基因的表达。1.2供试品抗CD20单抗参比品和供试品为本室留样。1.3主要试剂及仪器胎牛血清（FBS）、无酚红RPMI1640培养基、MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）及潮霉素B溶液为GIBCO公司产品；牛血

7、清白蛋白（BSA）、G418硫酸盐及Bio-GloTMLuciferaseAssaysystem为Promega公司产品；M5多功能酶标仪及SoftMax分析软件为美国MolecularDevices公司产品；PLA2.0平行线分析软件为Stegmann公司产品。1.4ADCC剂量效应曲线的绘制收集对数生长期的WIL2-S细胞及Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞，1000rpm离心5min后以含0.5%BSA的无酚红RPMI1640培养基（稀释液）重悬细胞，调整细胞浓度分别至1×106