载基因微球的制备及其在促进内皮细胞增殖方面的初步应用.pdf

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1、天津大学博士学位论文载基因微球的制备及其在促进内皮细胞增殖方面的初步应用PreparationofMicroparticlesforGeneCarriersandTheirPreliminaryApplicationinPromotingEndothelialCells’Proliferation一级学科：化学工程与技术学科专业：生物化工作者姓名：石长灿指导教师：姚芳莲教授冯亚凯教授天津大学化工学院二零一四年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表

2、或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：签字日期：年月日年月日 中

3、文摘要本文制备了可降解载基因微球(Microparticles，MPs)，利用MPs/pEGFP-ZNF580复合物转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs），达到了促进HUVECs增殖和迁移目的。针对高分子量聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)对细胞毒性高的问题，本文利用低分子量PEI制备了可降解型基因载体，并进行了评价。1.为了克服高分子量PEI作为基因载体引起的细胞毒性问题，以聚乙二醇单甲醚(mPEG)、3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮(MMD)、乙交酯(GA)和低分子量PEI为原料，制备了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-

4、吗啉-2,5-二酮-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物(mPEG-b-P(MMD-co-GA)-g-PEI)，经自组装形成“核-壳”结构MPs。其中，MPs的疏水“核”由P(MMD-co-GA)组成，以它作为交联点，连接着众多的PEI和PEG链段，从而形成具有亲水性且带正电荷的“壳”。MPs吸附并压缩ZNF580基因，形成MPs/pEGFP-ZNF580复合物。与高分子量PEI相比，MPs和MPs/pEGFP-ZNF580复合物的细胞毒性大大降低。MPs/pEGFP-ZNF580复合物的转染效果与LipofectamineTM2000的转染效果相

5、似，经转染60小时后，HUVECs的增殖和迁移得到提高。本文提供了一种制备低毒性非病毒基因载体有效方法。2.为了达到pEGFP-ZNF580从MPs/pEGFP-ZNF580复合物中持续释放的目的，合成了具有不同降解速率的三嵌段共聚物，进而制备了具备不同降解速率疏水核心的MPs。首先，合成了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-PMMD-g-PEI)、甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA)-g-PEI

6、)和甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI)三嵌段共聚物。之后，经自组装形成了MPs。pEGFP-ZNF580能够通过该复合物转染进入HUVECs，westernblot分析表明ZNF580关键蛋白表达水平升高至35.74%-46.11%，pEGFP-ZNF580能够持续释放25天。这种MPs/pEGFP-ZNF580复合物在实现组织工程支架和人工血管的快速内皮化方面，具有潜在的应用价值。3.为了实现MPs对HUVECs的

7、选择性转染，通过接枝Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽，制备了靶向性三嵌段共聚物，即REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV(REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV)和REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯-共 聚-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV(REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV)。以此为基材制备了HUVECs靶向性MPs。在HUVECs和人

8、脐动脉平滑肌(HUASMCs)的共培养体系中，MPs/pEGFP-