pcr技术及其医学应用

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1、PCR技术及其医学应用PolymerasechainreactionThepolymerasechainreaction(PCR)：toamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技术。第一节PCR原理与特点一、PCR基本原理PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细

2、胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。Denaturation（变性）:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primera

3、nnealing（引物退火）:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++HowPCRworksPCRproceedsbysequentialcyclesof:1.DNAde

4、naturationThesampleDNAisdenaturedwithheattoformsinglestrandedDNA.与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其产生变性，形成单链DNA而游离于反应溶液中。2.单链DNA模板与引物退火(annealing)TheprimersareannealedtothesinglestrandedDNAbycoolingthesample.通常需要两个寡核苷酸作DNA合成的引物(primer)，这两个引物分别与待

5、扩增顺序两侧的模板DNA互补，在降低温度的过程中，通过控制退火条件，引物就能准确地配对在扩增区域的两侧。Primers引物PCRprimers：about18to30ntlongandwithsimilarG+Ccontents.Tm=2(a+t)+4(g+c):determineannealingtemperature.Iftheprimeris18-30nt,annealingtemperaturecanbeTm5oC3.引物的延伸(extension)Theprimersareextend

6、edinthepresenceofDNApolymeraseanddeoxyribonucleosidetriphosphates,andcomplementarycopiesofthetargetDNAisproducedPCR在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸(dNTP)按引物5'-3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的半保留复制链，新合成的链又作为下轮循环反应的模板。EnzymesforPCRThemostcommonisTaqpolyme

7、rasefromThermusaquaticus.Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivity.Accuracyislow,notgoodforcloning.Thecycleisthenrepeated以上“变性、退火、延伸”三步曲，被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般只需30个循环.ThisprocesswillamplifytheoriginalDNAexponentiallysothatabout1millioncopiesoftheor

8、iginalsequencearepresentafter20cycles(220),and1billionarepresentafter30cycles(230).PCR的扩增倍数为(1+x)n，x为扩增效率，平均为75％，n为PCR的循环次数。尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA顺序的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷