检本 pcr技术及其应用

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1、PCR及其相关技术第一节聚合酶链式反应PCR聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction)KaryB.Mullis是一种利用DNA聚合酶在体外使特定的DNA片段进行大量快速合成的技术,可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。复制子代DNA[知识回顾]DNA的复制(replication)细胞内亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。亲代DNAATG…CATTAC…GTA5’3’3’5’ATG…CATTAC…GTA5’3’ATG…CATTAC…GTA3’5’1.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？2.在体外如

2、何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？一、PCR的反应过程变性94-97˚C延伸72˚C退火40-70˚C一、PCR的反应过程加热使双链DNA变为单链降温使引物和互补模板在局部形成杂交链耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应参与PCR反应的主要成份:1.模板Template2.引物Primers3.脱氧核苷三磷酸dNTP4.DNA聚合酶DNApolymerase5.缓冲液Buffer6.其它物质二、PCR的反应体系2)模板类型：可以是DNA，也可以是RNA3)模板来源：基因组DNA，质粒或线粒体DNA病毒RNA等模

3、板Template1)PCR模板：将要被复制的核酸片段4)模板要求：对纯度要求严格，用量很低（约50～100ng即可）二、PCR的反应体系TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeras

4、eTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA3’5’5’3’→Senseprimer←Antisenseprimer引物Primers一对与模板两条链的3’端互补的人工合成的寡核苷酸片段二、PCR的反应体系引物的重要性：能与模板特异地结合引物决定产物的长度引物决定产物的特异性引物设计时必须遵循一些原则二、PCR的反应体系引物设计的原则1、2条（上、下游），分别

5、与模板的2条链的3’端互补2、引物的长度一般为18～25个核苷酸3、避免两条引物间互补，特别是3’端的互补5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’引物二聚体二、PCR的反应体系引物设计的原则4、引物碱基组成平衡ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。G+C含量以45-55%为宜。5、引物退火温度计算Tm=2（A+T）+4（C+G）两条引物的Tm要接近，并决定退火稳定二、PCR的反应体系引物设计的原则6、引物的5′端加适当的修饰成分（引入酶切位点、引入突变位点

6、等）7、3′端碱基一定要与模板DNA严格配对引物浓度：0.1~0.2mol/L,浓度过高容易生成引物二聚体二、PCR的反应体系引物设计软件VectorNTIPrimer5.0OligoThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier4.10http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi;http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer;http://bioinformatics.weizmann.a

7、c.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html;http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html脱氧核苷三磷酸dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反应体系中4种核苷酸的摩尔浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加最适浓度：20～200μmol/L二、PCR的反应体系DNA聚合酶DNApolymerasePCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段，对

8、热的稳定性差。TaqDNA聚合酶从一种水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。二、PCR的反应体系DNA聚合