PCR技术及其应用.ppt

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1、PCR技术及其应用生物化学实验技术目录PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB引物dNTPMg2+5’3’Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040

2、20耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火变性、退火延伸TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1+P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反应缓冲液10xBuffer辅助因子：Mg2+1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特

3、异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP（10mMor2.5mM）含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2

4、+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数变性使双链DNA解链为单链94℃，30-60秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。Tm=（G+C）x4+（A+T）x2（3）延伸70-75℃,一般

5、为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的应用1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离或制备。A、DNAB、cDNA2、基因表达分析（原位、离体）A、基因是否表达B、基因表达水平高低3、基因突变基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂交双链PCR扩增1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特

6、异性荧光定量PCR（real-timePCR)分析基因表达水平通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI反向PCR(reversePCR)扩增已知序列两侧的未知序列用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA

7、片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR反应缓冲液25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂1.反应体系（50µl体系）：10