鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究

《鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究　　神经生长因子是神经系统最重要的生物活性分子之一，能够促进神经元的分化，维持神经元的存活[1]。鼠神经生长因子mNGF是一种从小鼠颌下腺分离出来的非共价键连接的多聚体蛋白。其生物学活性表现在能维持神经节细胞存活、诱导外周神经节外周突起生长[2]。鼠神经生长因子的生物学活性测定是其结构和功能研究的基础。目前，国际上用于NGF活性测定的方法主要有2种，即鸡胚背根神经节培养法和PC1细胞培养法[3-4]。由于细胞培养法对操作人员的经验、细胞库管理、细胞培养环境、检测仪器等方面要求较高且设备设施投入大，故国内神经生长因子生物

2、学活性测定的方法还是主要以鸡胚背根神经节培养法为主。但是鸡胚背根神经节培养法也存在干扰因素多，实验结果重复性较差的现象，故该文通过对鸡胚运输温度控制、神经节分离和接种时间限制、培养结果观察时间摸索、活性测定的浓度范围、重复性等试验，建立了一个简单、稳定、重复性好的鼠神经生长因子生物学活性的测定方法，有效地为鼠神经生长因子的生产过程监控和产品质量判定提供依据。　　1仪器与试剂　　仪器　　CO2培养箱，解剖显微镜，超净工作台、，倒置显微镜等。　　1.试剂　　鸡胚：购于珠海东坑鸡场的石歧鸡种蛋；鼠神经生长因子样品：丽珠集团丽珠制药厂自制；鼠神经生长因子标准品：来

3、自中国药品生物制品检定所，1000Au/支；DMEM：购于INVITROGEN公司；鼠尾胶联盟：丽珠集团丽珠制药厂自制。　　实验方法　　鼠尾胶原的涂布　　取自制鼠尾胶原均匀涂布于培养瓶中。将残留液吸尽后，于37℃生化培养箱中干燥。在接种神经节前，培养瓶先用DMEM培养基浸洗，接种前将DMEM培养基倒尽。　　培养基配制　　取DMEM1包，加葡萄糖g，L-谷氨酰胺，溶液1mL加纯化水溶解，加青霉素1000U、链霉素10000U，用碳酸氢钠调节pH=后定容至1000mL，无菌过滤使用。　　2.鸡胚背根神经节的分离和接种　　取孵育7～d鸡蛋，于超净台中，取出鸡胚置

4、于无菌培养皿中。于解剖显微镜下，从脊柱两侧分离出背根神经节，接种置培养瓶中。每瓶至少3个，于CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下温育至少1h。　　2.实验与培养　　样品组每瓶分别加入含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子的DMEM培养基各mL；标准品组每瓶分别加入含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子标准品的DMEM培养基各mL；阴性对照组加入DMEM培养基mL。将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养2h。　　2.结果观察　　在倒置显微镜下观察，用电子目镜拍摄。依神经节突起生长不同程度分为5个等级。神经节突起生长4个象限、呈树杈状

5、为“++++”；神经节突起生长3个象限、呈树杈状为“+++”；神经节突起生长2个象限者为“++”；神经节突起只有几根生长者为“+”；无突起生长者为“-”。　　2.结果判定及校正　　结果判定以神经节突起生长为“++++”时的样品稀释倍数计算效价。　　按下列公式进行效价的校正样品的活性=参考品活性　　实验结果与讨论　　鸡胚运输温度条件实验　　由于温度变化对鸡胚的生长发育有较大的影响，在气温较低的冬季，将种蛋分别用普通纸皮运输箱和采用保温泡沫箱内加电暖宝装置控制箱内温度在37℃左右的包装方式进行种蛋运输。取不同包装箱内的鸡胚摘取神经节接种后加入1AU/mL的mN

6、GF溶液或DMEM培养基后，放入CO2培养箱培养2h后进行观察神经节的生长情况。结果见表1。　　實验数据显示，鸡胚运输过程中采取保温泡沫箱内加电暖宝装置控制运输箱内温度在37℃左右，可以保证运输过程中鸡胚不被冻伤，接种后神经节不会脱落或因受伤神经节生长状态不好，造成实验结果差异较大。　　3.神经节分离和接种时间控制实验　　由于神经节需要在一定的温度、湿度下才能正常生长、发育。为保证神经节的生长成活率，进行了分离接种时间长短，对神经节的生长成活率的影响实验。取神经节接种后加入1AU/mL的mNGF溶液后，放入CO2培养箱培养2h后观察神经节的生长的存活率情况

7、。结果见表2。　　经过多次实验，观察到由于接种时间太长会造成神经节生长缓慢或因冻伤或失水而死亡，从而造成活性检测时出现样品无活性或无梯度等情况。认为保证在30min内完成神经节分离、接种并进行温育，是本实验的关键步骤。对于在冬季气温较低的条件下进行mNGF活性检测；鸡胚背根神经节分离接种操作不熟练者；或同时进行多批次检品检测需接种较多培养瓶时时间控制显得尤其重要。因此，为保证神经节的成活率应将接种后的培养瓶及时放入CO2培养箱中进行温育。3.培养结果观察时间摸索实验　　由于神经节的培养时间不同，其生长状况不一样。通过不同培养时间下对实验结果的观察，认为培养

8、24～3h为观察结果的最佳时间。培养时间4h，神经节的突起生长会变