cyp2b6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

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1、CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达【摘要】目的：构建CYP2B6基因原核表达质粒，在大肠杆菌［Rosetta2(DE3)pLysS］中高效表达重组蛋白。方法：以质粒为模板，用PCR技术扩增出CYP2B6基因，并将其分别插入pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)质粒中，经PCR、测序鉴定后，转化Rosetta2(DE3)pLysS，并用异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果：经PCR、测序鉴定，构建了CYP2B6基因表达质粒；采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白表达，pET_22b(+)_CYP2B6未见目的蛋白表达；pET_28b

2、(+)_CYP2B6有目的蛋白表达，约占蛋白总量的5%；而pET_32a(+)_CYP2B6可以高效地表达CYP2B6，在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3h后，所表达的CYP2B6蛋白约占细菌总蛋白的30%；质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2B6。结论：成功地使CYP2B6基因在原核系统中高效表达。【关键词】CYP2B6大肠杆菌表达［Abstract］Objective:ToconstructtheexpressionplasmidsofCYP2B6gene,andtoexpressCYP2B6proteininEscherichiacoli［Rosetta2(DE

3、3)pLysS］.Methods:TheCYP2B6genewasamplifiedbyPCRtechniquefromthetemplateoftheplasmidcontainingCYP2B6gene,thenwasinsertedinto10plasmidsofpET_22b(+),pET_28b(+),andpET_32a(+)respectively,andidentifiedwithPCRandsequencing.TherecombinantexpressionplasmidscontainingCYP2B6geneweretransformedintoRosetta

4、2(DE3)pLysSandthetargetproteinexpressionwasinducedbyisopropyl_β_D_thiogalactopyranoside(IPTG).Results:TherecombinantplasmidsofpET_22b(+)_CYP2B6,pET_28b(+)_CYP2B6,andpET_32a(+)_CYP2B6wereobtainedandidentifiedbyPCRandsequencing.CommassieBluestainingmethodwasusedtodetectthetargetproteinexpression.

5、ThepET_22b(+)_CYP2B6couldnotexpresstargetprotein,thepET_28b(+)_CYP2B6couldexpressCYP2B6proteinaccountingforabout5%oftotalprotein;ThetargetproteinwasgreatlyexpressedbypET_32a(+)_CYP2B6andtheexpressionlevelofCYP2B6proteinwastobeapproximately30%after3hoursinductionintheconcentrationof50μmol/LIPTG.

6、TheexpressedproteinwasCYP2B6proteinbythemassspectrometryresults.Conclusion:CYP2B6issuccessfullyconstructed,whichcanhighlyexpressobjectiveproteininRosetta2(DE3)pLysS.［KeyWords］CYP2B6;Escherichiacoli;expressionCYP450(cytochromeP450)10　　系统是机体对内、外源性物质，尤其是药物进行生物转化的重要酶系。CYP450是一个超家族，目前已确定的人类CYP450分属于

7、18个家族，42个亚家族［1］。在人体药物代谢过程中，主要有CYP1、CYP2和CYP33个家族。CYP2B6是CYP2家族中重要成员之一，它在肝脏中表达量差异比较大，可能与启动子区域单个核苷酸多态性(SNP)有关［2］；另外，在其他位置的SNP与酶的活性变化也有一定的关系［3,4］。这种遗传性因素决定着一些药物的个体化用药，如影响到CYP2B6的酶活性，或涉及到CYP2B6代谢的药物。为了更好地研究药物对CYP2B6酶活性的影响，筛选药物之间的相互作用，