结核分支杆菌Mtb84基因原核表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

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1、英汉缩略名词对照表英文缩写英文全称中文译名Ampampicillin氨苄青霉素Bpbasepair碱基对BCGBacillusCalmette-Guerin卡介苗CTLcytotoxicTlymphocyte细胞毒T细胞DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸GM-CSFgranulocyte-macrophagecolony粒细胞巨噬细胞HLAhumanlymphocyteantigen人类白细胞抗原IFN-γInterfer

2、onγγ-干扰素Igimmunoglobulim免疫球蛋白ILinterleukin白细胞介素IPTGisopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷Kbkilobasepair千碱基对KDkilodalton千道尔顿MHCmajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合体Mtb8.4mycobacteriumtuberculosis8.4antigen结核分支杆菌8.4抗原RPMratesperminute每分钟转速PCRpolymerasechainreacti

3、on多聚酶链反应PAGEpolyacrylamidgelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TNFtumornecrosisfactor肿瘤坏死因子Tristrishydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷TBtuberculosis肺结核TCRTcellreceptorT细胞受体TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineN,N,N’,N’-四甲基乙二铵结核分支杆菌Mtb8.4抗原原核表达质粒的构建

4、及在大肠杆菌中的表达摘要目的：构建结核分支杆菌分泌性低分子质量抗原Mtb8.4基因的原核表达重组质粒，并检测其在大肠杆菌中的表达。方法：采用PCR技术，以质粒pcDNA3.1(+)-Mtb8.4为模板，扩增出Mtb8.4基因；PCR产物胶回收纯化后，经限制性内切酶EcoRⅠ+NheⅠ双酶切,定向克隆到质粒pET-HisT7启动子的下游；双酶切和PCR法鉴定重组子；阳性重组子转化E.coliBL21（DE3）pLysS，经IPTG诱导后，使用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分析Mtb8.4蛋白质抗原在大肠杆菌中

5、的表达。结果：构建了结核分支杆菌Mtb8.4原核表达重组质粒pET-His-Mtb8.4，测序表明具有正确的编码序列；菌体蛋白经SDS-PAGE电泳，含阳性重组子的菌体蛋白中出现一新蛋白带,与预计相符。结论：构建的大肠杆菌重组体能够表达结核分支杆菌Mtb8.4蛋白质抗原，为进一步大规模抗原的纯化、相应抗体的制备及其免疫效应的检测奠定了基础；为进一步研究结核杆菌Mtb8.4抗原可否作为结核分支杆菌DNA疫苗或亚单位疫苗的候选成分提供理论依据。关键词：结核分支杆菌；低分子质量抗原；原核表达质粒；大肠杆菌；蛋白表达１Constructio

6、nofprokaryoticrecombinantplasmidofMtb8.4AntigenSecretedbyM.tuberculosisanditsexpressioninE.coliAbstract:Objective:Toconstructprokaryoticexpressionrecombinantplasmidencodingmtb8.4geneofM.tuberculosisanddetecttheproteinexpressioninEscherichiacoli.Methods：PlasmidpcDNA3.1(

7、+)-Mtb8.4astemplate,withthegeneencodingforproteinMtb8.4wasamplifiedwithtechniquepolymerasechainreaction(PCR).ThePCRproductsweredigestedwiththerestrictionendonucleasesEcoRⅠ+NheⅠafterpurifiedbymeansofgelatumretrieving.ThegenewasclonedintothedownstreamoftheT7promoterpET-H

8、isvector.PositiveclonewasscreenedusingdoubledigestionandPCR.RecombinantplasmidwastransformedintoE.coliBL21（DE3）pLysS.