nt4apoptinha2tat融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定

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1、NT4ApoptinHA2TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定【摘要】目的:构建编码融合基因NT4ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4ApoptinHA2TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK293细胞,通过同源重组获得NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dotblot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4Apopti

2、nHA2TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4ApoptinHA2TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。【关键词】NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒肿

3、瘤融合基因　　近年来不损伤正常细胞的蛋白质和相关肽的发现为肿瘤的基因治疗带来了转机,利用重组腺病毒转导这类基因,注射实体瘤之后,9可以在一个较长的时间内持续表达杀伤肿瘤的蛋白［1］。体外合成或基因工程表达的CAVVP3蛋白Apoptin能特异地诱导多种人源性恶性肿瘤细胞的凋亡,但对正常二倍体体细胞无作用［2］。本研究在前期工作的基础上拟构建神经生长因子4(NT4)信号肽引导的可分泌表达ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒高效表达载体,为下一步进行Apoptin应用于基因治疗奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料克隆载体pGEMT/Apoptin质粒

4、有本课题组构建［3］;限制性内切酶NaeⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ购自宝泰克生物公司;TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自华美生物公司;pUC19/NT4质粒、pGEMT/HA2TAT、腺病毒穿梭质粒pSSCMV及辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140,大肠杆菌DH5α及293细胞系、小鼠成纤维细胞NIH3T3、HepG2人肝癌细胞系均由西安华广生物工程公司提供。　　1.2方法　　1.2.1pUC19/NT4ApoptinHA2TAT载体构建碱裂解法大量制备重组质粒pGEMT/Apoptin、pGEMT/HA2TAT,分别用限制

5、性内切酶NaeⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ消化,切取Apoptin、HA29TAT用T4DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化pUC19/NT4载体。用连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coliDH5α菌株,随机挑选单个菌落,接种于含有氨苄西林的LB培养基内,37℃增殖培养,碱裂解法小量提取质粒,用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,筛选出含有约710bp左右的重组质粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT。　　1.2.2腺病毒穿梭质粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的构建EcoRⅠ和SalⅠ双酶切腺病毒穿梭质粒pSSCMV和E

6、coRⅠ和XhoⅠ双酶切pUC19/NT4ApoptinHA2TAT,低熔点凝胶回收NT4ApoptinHA2TAT和线性化的pSSCMV,T4DNA连接酶连接,转化E.coliDH5α感受态细菌,挑选转化的菌落,提取质粒,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选并鉴定阳性克隆。　　1.2.3重组腺相关病毒的包装与鉴定及滴度测定采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK293细胞获取重组腺相关病毒。转染3d后,质粒在细胞内同源重组构建出重组腺相关病毒,毒斑出现,反复冻融含病毒栓子的培养基,提取病毒,收集含病毒的上清液感染80%成片的HEK293细胞。Dotblot

7、法测定重组病毒滴度。　　1.2.4重组腺相关病毒对HepG2细胞存活率的影响将HepG2细胞以每孔10000个细胞的量接种于96孔培养板中,每孔体积200μL,培养24h后分实验组、9正常细胞小鼠成纤维细胞NIH3T3组和空病毒组,各加入10MOI的空病毒或重组病毒,病毒作用2h后更换新鲜正常培养液,在病毒作用后的24、48、72h分别终止培养(以上每组各设3个复孔),加入MTT试剂(5g/L)20μL,37℃孵育4h,将含MTT的培养液移去,加入二甲基亚砜150μL,摇匀15min,使反应产物充分溶解。在测定波长为490nm的酶标仪上测定光密度A值。　　2结果　

8、　2.1重