资源描述：
《nt4antshepherdin［7987］融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、NT4AntShepherdin［7987］融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定：汤小江,平宝华,潘承恩,杨广笑,王全颖【摘要】 目的:设计构建融合基因NT4AntShepherdin［7987］的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备AntShepherdin［7987］cDNA片段,通过连接pGEMTEasy载体及PBV220NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4AntShepherdin［7987］融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHGCMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK
2、293细胞获取重组腺相关病毒,Dotblot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成AntShepherdin［7987］基因,连接PBV220NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4AntShepherdin［7987］目的基因;得到高滴度的（3.4×1013pfu/L）重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4AntShepherdin［7987］的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4AntShepherdin［7
3、987］融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。【关键词】Survivin;Ant;NT4;融合基因;重组腺相关病毒 Survivin是由Ambrosini等［1］于1997年发现的,是凋亡抑制蛋白（inhabitofapoptosisprotein,IAP）家族的重要成员。Survivin基因位于人类17号染色体的q25区,全长14.7kb,编码含142个氨基酸,相对分子质量（Mr）为16500的胞质蛋白。Survivin在大多数实体瘤及血液系统肿瘤中,Survivin呈现高表达,在大多数终
4、末组织不表达［2］。这种独特的表达特性使其成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点,近年来针对Survivin进行了广泛的肿瘤靶向治疗研究,包括有:反义寡核苷酸、显负性突变体、核酶、小干扰RNA（SiRNA）、疫苗及免疫治疗、小分子拮抗物等［3］。近来研究发现,热休克蛋白90（Hsp90）可以与Survivin结合,保护Survivin不被泛素蛋白酶体降解［4］。Survivin与Hsp90结合区位于其Lys79至Leu87区域,因而,有研究者设计与其相同序列的9肽,命名为Shepherdin［7987］。作为拮抗物,Shepherdin［7987］
5、竞争干扰Survivin与Hsp90结合,促进Survivin降解,实验表明具有很好的抗肿瘤效果,且无明显的毒副作用［5］。基于此,我们设计构建了包含细胞穿膜肽及信号肽功能的NT4AntShepherdin［7987］融合基因的腺相关病毒载体,为实现以Shepherdin为抗肿瘤目的肽的基因治疗奠定基础。 1材料和方法 1.1材料克隆载体pGEMTEasy质粒（50ng/μL）购自Promega公司;限制性内切酶NaeI、BamHI、EcoRI、TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶、TRIzol试剂盒等试剂购自华美生物工程公司;pBV2
6、20NT4质粒,辅助质粒pAAVAd,腺病毒全基因组质粒pFG140,腺相关病毒穿梭质粒pSSHGCMV,293细胞系,大肠杆菌TOP10、E.coliDH5α菌株、A549人肺癌细胞系等由西安华广生物工程公司提供。 1.2方法 1.2.1引物设计与合成根据GenBank提供的人Survivin7987位氨基酸序列KHSSGCAFL及细胞穿膜肽Ant（黑腹果蝇触足肽Antennapedia）的异构体氨基酸序列GRQVKVKHI酶切位点,应用DNASIS计算机软件设计下列引物,引物/模板合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成,PAGE纯
7、化。正向引物/模板F:5′CGCCGGCGTGGGAAGAAGTGGAAGATGCGCCGGAATCAGTTCTGGGTAAAGGTAC;负向引物/模板R:5′CGGATCCTCAAAGGAAAGCGCAACCGGACGAATGCTTTCCGCGCTGTACCTTTACC。 1.2.3pBV220/NT4AntShepherdin［7987］载体构建碱裂解法大量制备重组质粒pGEMT/AntShepherdin［7987］,用限制性内切酶NaeI彻底消化后再用BamHI消化,凝胶电泳分离、透析带洗脱获取AntShepherdin［
8、7987］,用T4DNA连接酶连入带有相同末端、携带神经生长因子4（NT4）信号肽的质粒载体pBV220
