一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

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1、一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立作者：白龙梅,李学忠,张志琳,刘春风【摘要】　　目的:通过胚胎中脑祖细胞(MPC)体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法:取自E12鼠胚中脑腹侧的MPC悬液在添加bFGF的DMEM/F12/N2/L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐(AA-2P)培养液中扩增培养,5d后停用bFGF,促进细胞分化,4d后通过Neurobasal/阿糖胞苷(Ara-c)抑制胶质细胞生长,获得纯神经元,使用TH鉴定细胞,计数细胞比例和纯度,β-tubulinIII鉴定成熟神经元,

2、并计数细胞比例和纯度。结果:在添加了bFGF20μg/L的DMEM/F12/N2/AA-2P培养液中MPC增殖良好,体外培养7d后细胞数量扩增到培养前的(16.54±1.25)倍;使用Neurobasal/阿糖胞苷后胶质细胞受抑制,神经元占94%以上,其中多巴胺(DA)能神经元的比例约(35.56±4.13)%。结论:E12鼠胚MPC原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度DA能神经元培养体系的可靠途径。【关键词】中脑前体细胞多巴胺能神经元细胞培养　　为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法,常需在单细胞水平了

3、解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、药物的反应。因此,高纯度、高质量、10稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养,是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞(mesencephalicprogenitorcells,MPC)体外培养技术,旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。　　1材料和方法　　1.1材料E12Sprague-Dawley孕鼠由苏州大学动物中心提供;DMEM/F12培养液、无血清培养添加剂N2、胎牛血清(FBS)、25g/L胰酶消化液

4、均购自Gibco公司;碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐（L-ascroidacid-2-phosphateSesquimagnesiumSalt,AA-2P）、阿糖胞苷（arabinosylcytosin,Ara-c）均购自Sigma公司;兔抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体（mAb）购自Novus公司（编号300-109);小鼠抗β-TubulinⅢmAb购自Chemicon公司;免疫组化试剂盒购自Boster公司

5、;抗小鼠cy2免疫荧光染色试剂盒、抗兔cy3免疫荧光染色试剂盒和Hoechst33258免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及绘制生长曲线MPC的培养参照Yu等［1,2］方法并适当修改,简述如下,E12孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒,10剖腹取出子宫置于10cm的消毒玻璃培养皿中;剪开子宫取出胚囊,用镊子撕破羊膜囊取出长约6～8mm(顶臀径)的胚胎,置入另一盛有D-Hanks液的玻璃皿中;在解剖显微镜下切取中脑曲,切开中脑导水管腹侧,切取中央约0.5mm×0.6

6、mm×0.4mm的中脑腹侧部分,置入约含0.5mL取材液（2∶1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、20g/LB27、10g/LN2、0.2g/LDNase）的1.5mL的EP管中,分别用1mL和0.2mL的枪头反复吹吸15次;静置3min,去除沉淀,依胚胎数量加入1～5mL培养液（2∶1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、20g/LB27、10g/LN2、10mL/LFBS、20μg/LbFGF、100μmol/LAA-2P）,玻璃移液管吹吸分散悬浮细胞。取10μL细胞悬液加入10μL4g/L台

7、盼蓝溶液,充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例;调整细胞悬液密度至3×108/L,部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶中,每个培养瓶中加人3mL细胞悬液。部分接种在用多聚赖氨酸包被的2个24孔培养板中,其中1个24孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片,另一个不放,每孔中加入500μL细胞悬液,37℃、50mL/LCO2细胞培养箱中培养24h,细胞贴壁后吸除全部培养液,重新加入无血清培养液（2∶1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、10g/LN2、20μg/LbFGF、100μmol/

8、LAA-2P）继续培养,隔天更换半量培养液。细胞培养5d后吸除全部培养液,换培养液（Neurobasal、20g/LB27、10mL/LFBS、100μmol/LAA-2P、9g/L谷胺酰胺）,隔天更换半量培养液继续培养4d。接种在培养板中的细胞爬片在第5、7、9天取出分别用于免疫组化、免疫荧光鉴定。接种在24孔板中的细胞在第2、104、7、9天接种分别随机取6孔,加入25g/L胰酶消化,吹打成单细胞悬液,台盼蓝计数,计算平均每孔细胞数并记录,绘制原代培