一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

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1、万方数据!曼型!鲤2二墨!兰墨绁胞皇公王丝痤堂盘查(垦b也』垦趔丛!!!型塑婪望竺12至塑墨：丝(璺2403·论著·文章编号：1007—8738(2008)04—0403—03一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立白龙梅1，李学忠1一，张志琳1，刘春风1’2·(苏州大学：1附属第二医院神经内科，2衰老与神经疾病实验室，江苏苏州215004)[摘要]目的：通过胚胎中脑祖细胞(MPC)体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法：取自E12鼠胚中脑腹侧的MPC悬液在添加bFGF的DMEwFl2／N2

2、／I广抗坏血酸一2一磷酸酯倍半镁盐(从-2P)培养液中扩增培养，5d后停用bFGF，促进细胞分化，4d后通过Neurob鹊彬阿糖胞苷(Am-c)抑制胶质细胞生长，获得纯神经元，使用7m鉴定细胞，计数细胞比例和纯度，B-tubulinⅡI鉴定成熟神经元，并计数细胞比例和纯度。结果：在添加了bFGF20彬L的DMEⅣF12／N2／AA-2P培养液中MPC增殖良好，体外培养7d后细胞数量扩增到培养前的(16．54±1．25)倍；使用Neu-mb船aL／阿糖胞苷后胶质细胞受抑制，神经元占94％以上，其中多巴

3、胺(DA)能神经元的比例约(35．56士4．13)％。结论：E12鼠胚MPC原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度DA能神经元培养体系的可靠途径。[关键词]中脑前体细胞；多巴胺能神经元；细胞培养[中图分类号】R392．1【文献标识码】A为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞(mesencephalicpmgen

4、itorceⅡs，MPC)体外培养技术，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。1材料和方法1．1材料E12Sp礓gLle—Dawley孕鼠由苏州大学动物中心提供；DMEwFl2培养液、无血清培养添加剂N2、胎牛血清(FBS)、25g／L胰酶消化液均购自Gibco公司；碱性成纤维生长因子(b鹊ic硒mbl鹊t鲫他factor，bFGF)、L-抗坏血酸一2-磷酸酯倍半镁盐(L—a8cr}oidacid一2一phosphatesesquima印e8i啪salt，从一2P)、阿糖胞

5、苷(眦binosylcyt08in，A姐一c)均购自si蛐公司；兔抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体(mAb)购自Novlls公司(编号300—109)；小鼠抗B．TubIdinⅢmAb购自收稿日期：2007—04一19；接受日期：2007一09—12基金项目：江苏省“六大人才高峰”资助课题(卫生02—2)作者简介：白龙梅(1980一)，女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士Tbl：0512—6778330r7；E-mail：Huc亿O@ho劬ail．c咖木Com8pondillg¨thorcheIIlicon公

6、司；免疫组化试剂盒购自Boster公司；抗小鼠cy2免疫荧光染色试剂盒、抗兔cy3免疫荧光染色试剂盒和H0ecllst33258免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。1．2方法1．2．1细胞培养及绘制生长曲线MPC的培养参照Yu等H’纠方法并适当修改，简述如下，E12孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒，剖腹取出子宫置于lOcm的消毒玻璃培养皿中；剪开子宫取出胚囊，用镊子撕破羊膜囊取出长约6～8mm(顶臀径)的胚胎，置入另一盛有D—HaIll【s液的玻璃皿中；在解剖显微镜下切取中脑曲。切开中脑导水管腹侧

7、，切取中央约0．5姗×0．6mmx0．4咖的中脑腹侧部分，置入约含0．5nlL取材液(2：1的DME彬F12、2g／L碳酸氢钠、20g／LB27、10g／LN2、0．2g／LDN鹅e)的1．5lllL的EP管中，分别用lmL和0．2mL的枪头反复吹吸15次；静置3lllin，去除沉淀，依胚胎数量加入1～5mL培养液(2：1的DMEM／F12、2晷／L碳酸氢钠、20g／LB27、10g／LN2、lOmL／LFBs、20恤矿LbFGF、100斗m彤LAA一2P)，玻璃移液管吹吸分散悬浮细胞。取lo止细胞

8、悬液加入10灿4∥L台盼蓝溶液，充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例；调整细胞悬液密度至3×108／L，部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶中，每个培养瓶中加人3mL细胞悬液。部分接种在用多聚赖氨酸包被的2个24孔培养板中，其中1个24孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片，另一个不放，每孔中加入500止细胞悬液，37℃、50mL／LcO：细胞培养箱中培养24h，细胞贴壁后吸除全部培养液，重新加入无血清培养液(2：1的DMEMyFl2、2g／L碳酸氢钠、