健康人apobec3g基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

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1、健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定作者：甘宜敏，孔凡运，史震，汤仁仙，郑葵阳【摘要】目的克隆人载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoproteinBmRNAeditingenzyme，catalyticpolypeptide3G，APOBEC3G)基因cDNA，构建APOBEC3G基因的真核表达载体，并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒

2、，并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞，经免疫细胞化学、Westernblot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明，APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Westernblot结果均显示，转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达，转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G真核表

3、达载体pcDNA3.1-A3G，为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。【关键词】APOBEC3G;克隆;真核表达载体　　Abstract：ObjectiveToclonethecDNAofhuman10apolipoproteinBmRNAeditingenzyme,catalyticpolypeptide-like3G(APOBEC3G)geneandconstructtheeukaryoticexpressionvectorfortheinvitroexpressionandidentificati

4、on.MethodsThecodingregionofAPOBEC3GgenewasamplifiedbyRT-PCRfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)ofhealthyhumans,andthenthegenefragmentwasinsertedintotherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1toconstructtheeukaryoticexpressionplasmidofpcDNA3.1-A3G,whic

5、hwastransfectedintoHepG2andHL7702cells,respectively.TheexpressedproductsintheHepG2andHL7702cellsweredetectedbyimmunocytochemistryandWesternblot.ResultsTheresultsofdoubleenzymedigestionandsequencingshowedthatthepcDNA3.1-A3G-transfectedHepG2andHL7702cellswerebothh

6、ighlyexpressed,whilethecellstransfectedwiththeblankplasmidpcDNA3.1andthoseuntransfectedcellswerelowexpressedorunexpressed.ConclusionTheeukaryoticexpressionvectorofhumanAPOBEC3G,i.e.,pcDNA3.1-A3Gwassuccessfullyconstructed,whichlaysanexperimentalbasisforthestudyof

7、APOBEC3GagainstHBV.　　Keywords：APOBEC3G;clone;eukaryoticexpressionvector10　　人载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G(APOBEC3G)[1]是在研究HIV时发现的一种RNA/DNA编辑酶，具有胞嘧啶脱氨酶活性，可使胞嘧啶(C)脱氨基变为尿嘧啶(U)，从而诱导病毒基因组发生碱基突变。其可抑制病毒感染因子(virioninfectivityfactor，vif)缺陷性(△vif)HIV-1在非允许细胞(如巨噬细胞、Hut68和人T淋巴瘤细胞系CEM

8、等)内的复制，成为近年来逆转录病毒研究领域的一项重大进展。HBV虽不属于逆转录病毒，但其有一个与HIV类似的逆转录复制过程。有研究表明APOBEC3G可抑制HBV复制[2-3]，但具体机制不明确。本实验从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，并构建该基因的真核表达载体，为后续研究APOBEC3G抑制HBV复制的作用机制