生物化学实验原理与技术

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1、生物化学实验原理与技术中国农业科学院研究生院生物化学与分子生物学教研室1999年12月60目录蛋白质化学部分实验一多酚氧化酶（PPO）的分离纯化…………4实验二多酚氧化酶（PPO）的活性测定…………8实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度…10实验四SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定……………………12实验五等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点……16实验六多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测……19免疫学部分实验七多酚氧化酶（PPO）抗体的制备………24实验八多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳……31实验九多

2、酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳……33实验十Westernbloting技术…………………40实验十一亲和层析法分离纯化胰蛋白酶…………44核酸化学部分60实验十二植物染色体DNA的提取………………52实验十三质粒DNA的提取与纯化………………54实验十四DNA片断的酶切技术…………………57实验十五DNA片断的连接技术…………………59实验十六受体菌感受态细胞的制备……………61实验十七重组DNA片断的转化、克隆及筛选…62作业实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实

3、验结果讨论。实验结果照片、图表等要附在实验报告中。蛋白质化学部分60实验一多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化一、实验原理与目的多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与

4、动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：氧化底物NADH＋H+醌H2O底物NAD+酚1/2O2但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量

5、。在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE60－纤维素DE－52柱层析、聚乙二醇反渗透浓缩、葡聚糖凝胶SephadexG-200柱层析获得PPO的纯酶液；然后对其进行酶蛋白含量检测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和PPO同功酶的分析，以及

6、通过免疫学的分析对多酚氧化酶（PPO）进行理化、生化特性进行鉴定。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的系统技术。二、材料（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgC

7、l2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02MTris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001MEDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml；NaCl:聚乙二醇：DEAE－纤维素DE52；葡聚糖凝胶SephadexG-200:（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；60透析袋：过滤纱布；层析柱；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；恒流泵；梯度混合仪；核酸蛋白检测议；GL－20C高速冷冻离心机；DL－7A大容量低速冷冻离心机：三、方法与步骤（1）粗酶提取：水果肉组织按1:1（W/V）比

8、例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。（2）硫酸铵沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），