生物化学实验技术与方法

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1、生物化学实验技术与方法实验讲义生物化学教研室（2005年9月）目录实验一:糖的薄层分析2实验二：高等植物DNA的提取和纯度鉴定3实验三：苯丙氨酸解氨酶的纯化和活性测定实验四：SDS■聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量实验一糖的薄层层析一.实验冃的学习和掌握薄层层析的原理和方法二.实验原理薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开,使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。根据原理的不同薄层层析通常有4

2、种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。硅胶H是粘性差的纯硅胶；其特性是能用腐蚀性显色剂检测。三.实验操作1.硅胶H薄板的制备：注意胶要均匀。2.板的处理：薄板的活化：活化后冷却的速度不能过快。薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：样品为鼠李糖、甘露糖、木糖和葡萄糖。点样量20-30ulo注意：点样点的直径小于2mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层溶剂为：

3、乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。5.显色：显色剂：苯胺■二苯胺■磷酸试剂。四.结果与讨论1・根据显色结果，计算Rf值，根据颜色、Rf值判断糖的存在。2.哪些因素对薄层层析的结果产生影响？实验二高等植物DNA的提取和纯度鉴定一、实验目的掌握提取真核细胞DNA的一种基本方法，学习紫外吸收法测定DNA的含量和纯度。二、实验原理高浓度的盐和离子表面活性剂SDS能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP）,使DNA释放岀来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶

4、于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可除去一些盐分，经RNase降解RNA,可得较纯的DNAoDNA含量与纯度的测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式（DNA[ug/ml]=A26oX50X稀释倍数）可计算出DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A26o/A28O〈1.8时，表明蛋白质含量偏高；A260/A280〈1.9时，表明样品较纯；A26

5、o/A28o>2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。三、仪器、试剂和材料1、仪器普通离心机；冰箱；恒温水浴箱；紫外分光光度计；可调整微量取样器；50ml量筒；2ml烧杯；滴管2、试剂抽提液（2mol/LNaCl-1mmol/LEDTA）；10%SDS；盐饱和苯酚（SS■苯酚）：重蒸苯酚用lmol/Ltris-HCl缓冲液（pH8.0）饱和；氯仿一异戊醇（24：1）；95%乙醇;70%乙醇；TE缓冲液（10mmol/Ltris・HC,1mmol/LEDTA,pH8.0）；RNase3、材料植物材料或丙

6、酮粉四、操作步骤1、DNA的提取(1)将已制备好的丙酮粉转入50ml离心管。(2)加15ml抽提液及1.5mll0%SDS,搅拌后放入60°C恒温水浴2h。(3)离心(4000r/min,8min,25°C),上清夜转入100ml离心管中。(4)分别加入一倍体积的SS•苯酚和氯仿一异戊醇，盖上离心管盖，轻轻倒转混匀。(5)再离心(4000r/min,8min,25°C),用干净滴管取上层水相转入50ml烧杯中。(6)加入二倍体积预冷的95%乙醇，置冰箱冷冻层0.5-2ho(7)用玻璃棒将DNA沉淀轻

7、轻捞起，转移至干净的50ml离心管，加入5ml70%乙醇浸泡数分钟，离心后弃去乙醇，管口扣于吸水纸上，吸去残留溶液。(8)加入4mlTE缓冲液，摇动，使沉淀完全溶解。(9)加入Rnase液10ul,37°C水浴1h。(10)重复步骤(4)-(8)o2、DNA紫外测定以TE作空白调零，在波长260nm和280nm处分别测定样液的吸光值。五、结果处理1、计算样品液屮DNA含量(ug)o2、分析样品纯度。六、注意事项离心管中加入SS■苯酚和氯仿一异戊醇后，需轻轻倒转混匀，此时注意动作的力度。七、思考题1、

8、为什么实验步骤(1)・(5)没有在冰浴条件下进行？2、实验中数次离心，每次离心后应保留哪部分？弃去的部分主要含什么？实验三苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定一、实验目的掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。二、实验原理苯丙氨酸解氨酶（L・phenylalanine：ammonialyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵