促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

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1、促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究　　【摘要】目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经巢蛋白(Nestin)的表达情况，流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高(49．7%)。结论bFGF、BHA

2、能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。　　【关键词】骨髓;间充质干细胞;诱导分化;神经元样细胞　　　　【Abstract】ObjectiveToexplorethemeansoftransdifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSC)ofadultrattoneuronlikecellsinvitro.MethodsBMSCswhichwereisolatedfromadultratsusinggradientcentrifugationandsubculturedifferentiationwerei

3、nducedintoneuronlikecellsbycytokineandoxidane.Immunocytochemistryanalysisaexaminationwasperformed.aboutneuronspecificenolase(NSE)、neurofilamentprotein(NF)andglialfibrillaryacidicprotein7(GFAP)andflowingcytometryanalysisexaminationwasperfpomedinductivity.ResultsTheBMSCcouldbetransdifferentia

4、tedtoneuronlikecellswiththeexpressionofNestin.TheinduciblerateofBMSCwithbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)、butylatedhydroxyarisol(BHA)was49．8%.ConclusionbFGF、BHAcanfacilitatetheprocessofBMSCbeingdifferentiatedintoNeuralprecursorcells.　　【Keywords】Bonemarrow;Mesenchymalstemcells;Inductiondiff

5、erentiation;Neuronlikecells　　　　探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的体外分离、纯化、扩增、传代培养及定向诱导分化为神经元样细胞的更好方法,为BMSCs在神经系统疾病的临床应用提供理论依据和技术方法。　　1材料与方法　　1．1材料和试剂成年Wistar大鼠,体质量120g左右。Percoll分离液(美国Pharmacia公司),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,R&D公司),β2巯基乙醇(β2ME)、硫代甘油、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO,Sig

6、ma公司),兔抗大鼠神经元烯醇化酶(NSEMaxim公司)多克隆抗体、兔抗大鼠神经丝蛋白(NF2Maxim公司)多克隆抗体和胶质纤维酸性蛋白(GFAPMaxim公司)多克隆抗体及兔抗大鼠神经巢蛋白(Nestin,Pharmingen公司)多克隆抗体。7　　1．2原代及传代培养取成年的Wistar大鼠两侧股骨及胫骨,去两端后将腔内骨髓细胞冲出,利用Percoll分离液(1．073×103g/ml)进行梯度分离后,取含BMSCs的低密度层到MSCGM(骨髓间充质干细胞专用培养基)中,在37℃,体积分数为5%CO2,95%湿度常规培养。细胞达90%融合后传代。　　1．3定向诱

7、导MSCs分化　　取3～5代的BMSCs按0．4×106/ml接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片,对照组采用方法a:1mmol/L硫代甘油的DMEM(10%FBS)预诱导24h,更换培养液,PBS洗涤3次,再加入含5mmol/L硫代甘油的无血清DMEM诱导5h～6d。诱导出神经元样细胞最多时换用神经细胞培养基。实验组采用方法b预诱导试剂为10ng/mlbFGF,正式诱导试剂是200μmol/LBHA,其他条件不变。　　1．5镜下对神经前体细胞进行形态学观察。　　1．6细胞免疫组化检测