大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为神经元样细胞的实验研究

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1、l前言1．1研究背景神经元为永生型细胞，而神经系统损伤和退行性、遗传性病变如帕金森氏病(Parkinsondisease，PD)，阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，亨廷顿氏病(Huntingtondisease，HD)等都可致神经元功能不可逆转，这一直是人类努力去攻克的难题。BMSCs作为一种具有多向分化潜能的多能干细胞，在体外特定的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞和肺细胞等多种细胞，特别是其能向神经细胞分化的潜能，成为神经科学领域的一个研究热点

2、。BMSCs具有以下特性：①易于从骨髓中获取；②体外能迅速增殖；③在脑组织中易于存活且能迁移而极少影响受体的正常功能；④与受体脑组织有极好的相容性，免疫排斥反应相对较少；⑤在一定的诱导分化条件下能分化为具有一定功能的神经细胞。尽管有关BMSCs向神经细胞分化的研究已获得了一些成果，但仍有一些问题尚待解决：@BMSCs的分离、纯化及鉴定：骨髓细胞为多种细胞的混杂，如何高效地分离和纯化BMSCs，完善细胞鉴定条件，如寻找特异免疫表型，从而确保取材细胞是BMSCs，这是深入研究的必要条件；②分化为神经细

3、胞的机制：国内外很多研究显示，BMSCs可以向神经元细胞分化，但其机制尚不明了，由于取材细胞受机体年龄、培养条件、实验操作乃至移植受体内微环境等各种因素的影响，如何确保BMSCs分化为神经细胞的效率和安全性，亟待解决。1．2研究目的本实验体外培养分离纯化并扩增大鼠BMSCs，观察G．CSF对体外培养的BMSCs增殖的影响，继而探讨G．CSF和GDNF诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用，为干细胞移植治疗提供新的实验基础。1．3研究内容1．3．1分离纯化和体外扩增BMSCs；1．3．2BMSCs鉴

4、定：(1)免疫细胞化学检测细胞抗原表达；7(2)诱导为脂肪细胞；1．3．3MTT法检测G．CSF对BMSCs增殖力的影响；1．3．4神经元样细胞诱导及鉴定。82材料与方法2．1主要器材5415D型高速台式离心机5415R型高速台式冷冻离心机S姗l之形SBP210电子分析天平QL．901旋涡混合器PHS．25型pH计YX280B电热蒸汽消毒器Shelab水浴箱YJ．875清洁超净工作台C02恒温细胞培养箱光学显微镜倒置相差显微镜超低温冰箱MK3型酶标仪752紫外光栅分光光度计PCR仪(Masterc

5、yclergradient)GDS．8000PC凝胶成像及分析系统5415D低温离心机BIO．RADMINI．SUBCELLGT电泳槽Bio-Radpowerpac200电泳仪一次性塑料培养瓶(25em2Flask)6孔、96孔培养板微量移液器TipsPCR管9德国Eppendoff公司德国Eppendorf公司德国Sartorius公司江苏海门麒麟医用仪器厂上海雷磁仪器厂上海三申医疗器械有限公司上海医疗器械厂江苏吴江净化设备厂日本SANYO公司美国MicroStarAO公司日本Olympus公司

6、美国ThermoForma公司美国ThermoForma公司上海第三分析仪器厂德国Eppendorf公司美国U佃公司德国Eppendorf公司北京六一仪器厂美国ComingCostar公司美国ComingCostar公司德国Eppendorf公司美国Axygen公司2．2主要试剂DMEM／F12培养基胎牛血清HEPESO．4％台盼蓝溶液胰蛋白酶二甲基偶氮唑蓝MTT二甲基甲砜DMSO1％多聚赖氨酸PLL碱性成纤维细胞生长因子CDl4、CD34、CDl05兔抗大鼠多克隆一抗即用型SABC试剂盒地塞米松

7、胰岛素mⅣD(G．CSFGDNFTrizolRNA提取液MMLVRT／PCR试剂盒DEPCEB氯仿异丙醇无水乙醇琼脂糖2．3主要试剂的配制2．3．1PBS工作液(1)储存液：O．1moFL，pH7．2～7．4①准确称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：10Gibco公司Sigma公司Invitrogen公司Boster公司ICN公司Sigma公司Peprotech公司Invitrogen公司Gibeo公司Fluka公司Sigma公司广州化学试剂厂西班牙分装NaCl809Na2HP04。2H2011

8、．59KH2P0429KCI29②向烧杯中加入约800ml的三蒸水，玻璃棒充分搅拌溶解：③把溶液倒入容量瓶中定容，加入三蒸水将溶液定容至1000ml，摇匀；④滴加稀盐酸或稀NaOH将pH值调节至7．4；⑤分装PBS，137kPa、125℃、30分钟灭菌消毒；⑥冷却后于4。C保存。(2)工作液：0．01mol／L，pH7．2～7．4取储存液，按1：10倍稀释后24小时内使用。2．3．20．25％胰蛋白酶溶液(1)胰蛋白酶粉末250rag加入0．01mol／LPBS100ml，混匀，充