alzheimer患者血清中抗aβ42自身抗体的纯化及鉴定

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1、Alzheimer患者血清中抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定作者：段金海,徐书雯,莫建伟,向绍通,方运勇,汪华侨,莫思杰,胡涛,姚志彬【摘要】　　目的:纯化并鉴定阿尔茨海默病（AD）患者血清中抗Aβ42自身抗体。方法:选择AD患者做为研究对象,采集血清标本,测定抗体含量,用饱和硫酸铵沉淀血清得到IgG粗品,Aβ42免疫亲和柱层析对粗品IgG进一步分离纯化,采用PAGE电泳和Westernblot方法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果:用CNBr活化Sephrose4B柱层析纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体,纯度可达到90%。结论:CNBr

2、活化Sephrose4B层析柱可有效地从人血清中纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体,便于对自身抗体进一步研究,为AD的免疫治疗提供更多的信息。【关键词】阿尔茨海默病;自身抗体;血清　　阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是以进行性加重的记忆认知功能减退为主要临床特点的中枢神经系统退行性z疾病,主要病理特征为老年斑(senileplaques,SPs)及神经元纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFTs）。β淀粉样蛋白（amyloidβpeptide,Aβ）具有神经毒性,10其在脑内的生成增

3、多及异常聚集是AD发病的关键因素［1］。研究认为Aβ在体内可以诱导出抗Aβ自身抗体,因为从人免疫球蛋白可以分离出抗Aβ自身抗体［2］,并且可从人类B细胞克隆出Aβ抗体［3］。流行病学调查也发现,与正常人相比AD患者的血清和脑脊液含有低滴度的Aβ自身抗体［4］。虽然目前有小样本试验用含抗Aβ自身抗体的静脉用免疫球蛋白治疗AD［5］,但是这些自身抗体的病理生理作用仍然不清楚。在AD转基因鼠和Ⅰ期临床试验中,Aβ1-42疫苗可以诱导出特异性的Aβ42抗体,并显示出良好的免疫原性和安全性,但在Ⅱa期临床试验(AN1792)中,6%的受试者出现

4、了无菌性脑膜脑炎［6］。目前认为,脑炎的发生与Aβ1-42全肽及佐剂QS21导致的Th1细胞免疫反应有关。为进一步阐明AD患者体内自身抗体的免疫特性及临床价值,本课题组对自身抗体进行分离纯化分析,希望对AD的免疫治疗研究有所帮助。　　1材料和方法　　1.1研究对象随机选取2004-04/2008-03在广东省南海福利中心和广东省人民医院东病区神经内科住院的轻至中度AD患者50(男36,女14)例;年龄60～80岁,年龄平均(65.2±8.6)岁,病程2～5年,符合美国国立神经病学传染病及卒中研究所与AD和相关病协会（NINCDSAD

5、RDA）的诊断标准。所有患者均由两位神经内科医师做出诊断且患者视、听力及精神状态允许合作完成神经心理学测试。简易精神状态量表［MMSE,(13±4.51)分;108～22分］及日常活动量表［ADL（30.6±3.4）分;25～34分］评价患者认知行为功能状态,Loeb改良缺血量表评分均小于4分。受教育程度:文盲4例,小学4例,中学以上学历8例。所有研究对像均为右利手,均排除高血压、糖尿病、精神病史、酒精或药物滥用、肿瘤及自身免疫性疾病等。　　1.2材料Aβ42为Sigma公司产品,Aβ42单克隆抗体(mAb)8G7为Calbioche

6、m公司产品。96孔聚苯乙烯反应板为Greiner公司产品,HRP羊抗小鼠IgG为博士德公司产品,预染Marker为Invitrogen公司产品。PVDF膜为Biotech公司产品,标准品GSTAβ42由中山大学分子中心实验室的张革老师提供。电泳仪及转印系统为BioRad公司产品。CNBractivatedSepharose4B为GEHealthcare公司产品。　　1.3方法　　1.3.1血清标本的收集和处理清晨空腹采血,装入无菌试管,不加抗凝剂,室温静置30min后,4℃,1000g离心10min。上清分装入另外一支无菌管,

7、-70℃保存。　　1.3.2间接ELISA采用间接ELISA检测［7］,Aβ42（10μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反应板,每孔100μL,4℃孵育过夜。30mL/L小牛血清37℃封闭2h。加入倍比稀释的血清样品（从1∶1010开始稀释）。过氧化物酶标记山羊抗人IgG,1∶2000稀释,每孔100μL,37℃孵育40min,洗涤。TMB显色,2mol/LH2SO450μL中止,于波长450nm下测定每孔A值,以样本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1为阳性。mAb8G7作为阳性对照,建立标准曲线。　　1.3.3抗体纯化33%和50%饱和

8、硫酸铵盐析:按常规方法进行［8］。溴化氰(CNBr)活化的Sephrose4B柱层析:按试剂说明书操作,即取1.5gCNBractivatedSephrose4B冻干粉,溶胀、重悬后,与4mg的Aβ42蛋白混合,封闭、