alzheimer患者血清中抗aβ42自身抗体的纯化及鉴定

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1、Alzheimer患者血清中抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定：段金海,徐书雯,莫建伟,向绍通,方运勇,汪华侨,莫思杰,胡涛,姚志彬【摘要】　　目的:纯化并鉴定阿尔茨海默病（AD）患者血清中抗Aβ42自身抗体。方法:选择AD患者做为研究对象,采集血清标本,测定抗体含量,用饱和硫酸铵沉淀血清得到IgG粗品,Aβ42免疫亲和柱层析对粗品IgG进一步分离纯化,采用PAGE电泳和MSE,(13±4.51)分;8～22分］及日常活动量表［ADL（30.6±3.4）分;25～34分］评价患者认知行为功能状态,Loeb改良缺血量表评分均小于4分。受教育程度:文盲4例,小学4例,中学以上学历8例。所有研究对像

2、均为右利手,均排除高血压、糖尿病、精神病史、酒精或药物滥用、肿瘤及自身免疫性疾病等。　　1.2材料Aβ42为Sigma公司产品,Aβ42单克隆抗体(mAb)8G7为Calbiochem公司产品。96孔聚苯乙烯反应板为Greiner公司产品,HRP羊抗小鼠IgG为博士德公司产品,预染Marker为Invitrogen公司产品。PVDF膜为Biotech公司产品,标准品GSTAβ42由中山大学分子中心实验室的张革老师提供。电泳仪及转印系统为BioRad公司产品。BractivatedSepharose4B为GEHealthcare公司产品。　　1.3方法　　1.3.1血清标本的收集和处

3、理清晨空腹采血,装入无菌试管,不加抗凝剂,室温静置30min后,4℃,1000g离心10min。上清分装入另外一支无菌管,-70℃保存。　　1.3.2间接ELISA采用间接ELISA检测［7］,Aβ42（10μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反应板,每孔100μL,4℃孵育过夜。30mL/L小牛血清37℃封闭2h。加入倍比稀释的血清样品（从1∶10开始稀释）。过氧化物酶标记山羊抗人IgG,1∶2000稀释,每孔100μL,37℃孵育40min,洗涤。TMB显色,2mol/LH2SO450μL中止,于波长450nm下测定每孔A值,以样本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1为阳性。mAb8G7作为阳

4、性对照,建立标准曲线。　　1.3.3抗体纯化33%和50%饱和硫酸铵盐析:按常规方法进行［8］。溴化氰(Br)活化的Sephrose4B柱层析:按试剂说明书操作,即取1.5gBractivatedSephrose4B冻干粉,溶胀、重悬后,与4mg的Aβ42蛋白混合,封闭、洗涤后装柱。以50mLPBS(pH7.4)平衡柱(流速,60mL/h),加入盐析的粗提的IgG,用洗脱液（50mmol/LHCl甘氨酸缓冲液,pH分别为2.5和1.5交替进行）洗脱,出峰时收集流出的组分,用碳酸盐缓冲液调节pH至中性,透析48h,于4℃保存。纯化效果采用15g/LSDSPAGE进行分析。　　1.3.4

5、r)约为30000。加样时,每孔10μL(含Aβ4220μg),恒压120V电泳。卸胶、清洗及装架后,恒流50mA电转90min。取出PVDF膜经双蒸水洗涤、30mL/LBSA封闭和TBST洗涤后,依次加入1∶100纯化的样品和1∶2000的HRP羊抗人IgG,室温孵育2h,上述两步后分别用TBST洗涤5次,时间分别为1、2、3、4、5min。DAB显色。以小鼠抗人Aβ42mAb(8G7)作为阳性对照。　　1.3.5统计学分析全部数据采用SPSS11.0分析。　　2结果　　2.1间接ELISA结果发现AD患者血清中都出现抗Aβ42自身抗体,抗体浓度在（32.1±8.2）mg/L,范围为2

6、3～49mg/L。AD的抗体浓度与性别、棠炅浼癕MSE评分都没有相关关系。　　2.2亲和纯化以BractivatedSepharose4B层析柱纯化的人抗Aβ42自身抗体进行SDSPAGE分析,结果显示相对分子质量（Mr）在55000和25000有2条清晰的条谱带分别为轻、重链的特异条带,纯度可达90%(图1)。　　图1纯化的人抗Aβ42自身抗体进行SDSPAGE分析（略）　　2．3r为30000处有蛋白结合带,与GSTAβ42融合蛋白质的结合位置相符合（图2）。　　图2Ab;2:抗Aβ42自身抗体.　　3讨论　　研究发现,AD患者血清中含有低滴度的抗Aβ自身抗体,与成熟的老年斑结

7、合能力下降,对PC12细胞的保护作用也较健康老人下降,因此认为AD患者体内可能存在着的针对Aβ42的免疫耐受［10］。与以往结果相似,本研究显示AD患者的抗体含量与性别、棠炅浼癕MSE评分没有相关性［2］。虽然随着年龄的增加,老年人的免疫反应呈下降的趋势,但AD患者Aβ自身抗体含量的降低与老年人总体免疫反应水平下降无相关性［11］。因此这些结果提示,Aβ自身抗体的降低是AD患者特有的免疫低反应性。Monsonego等［1