flt3基因突变与il3受体α在急性髓系白血病的表达意义

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1、FLT3基因突变与IL3受体α在急性髓系白血病的表达意义作者：吴勇,陈景龙,骆社丹,陈元仲【摘要】目的研究FLT3基因突变与IL3受体α(IL3Rα)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。方法采用RTPCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测20例AML患者IL3Rα的表达水平及FLT3/ITD与D835突变。结果20例中IL3Rα高表达18例,FLT3/ITD突变7例,D835突变1例,总突变率44.4%,对照组未检测到FLT3/ITD突变。高表达IL3Rα与FLT3/ITD阳性患者外周

2、血白细胞计数高,白血病细胞比例高,完全缓解率低。结论IL3Rα高表达和FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势,检测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。【关键词】受体蛋白质酪氨酸激酶；串联重复序列；突变；受体，白细胞介素3；白血病，粒细胞，急性　　急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一种涉及多基因遗传学改变的恶性血液病,其特征为细胞分化成熟受阻,未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起源于被称为白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)的细胞

3、,而LSC13则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形成的异常产物。FLT3基因(FMS样酪氨酸激酶3,FMSliketyrosinekinase3)是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员的原癌基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变,主要包括内部串联重复突变(internaltandemduplication,ITD)和D835突变。IL3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一,IL3受体α亚基(IL3Rα,又叫CD123)是白血病干细胞的特异性标志,其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正常的造血干

4、细胞中不表达或表达很低[1]。本研究旨在探讨两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。　　1材料与方法　　1.1临床资料　　1.1.1标本采集和单个核细胞(MNC)的制备收集福建医科大学附属协和医院血液科2005年3月－2006年6月住院的20例急性髓系白血病患者外周血,年龄中位数35岁(32±3岁)。根据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分化型(M1)3例,急性原粒细胞白血病部分分化型(M2)7例,急性早幼粒细胞白血病(M3)4例,急性单核细胞白血病(M5)6例,外周血幼稚细胞均＞60%,用淋巴细胞分

5、离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80℃保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。13　　1.1.2仪器与试剂Trizol试剂(美国GIBCOL公司),反转录试剂盒(OmniscriptRTkit,德国Qiagen公司),PCR试剂盒(HotStarTaqMastermixkit,德国Qiagen公司),限制性内切酶EcoRV(美国NewEnglandBiolabs公司),琼脂糖(美国AMRESCO公司)。　　1.2细胞总RNA提取及cDNA合成用Trizol试剂提取细

6、胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260nm、280nm吸光度值(D),要求D260/D280>1.8。用反转录试剂盒将上述样本的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20μL,包括细胞总RNA1μg,10×逆转录反应缓冲液2μL,5mmol/LdNTPs2μL,10μmol/LoligodT20引物2μL,10U/μLRNA酶抑制剂1μL,4U/μL反转录酶1μL,余用无核酸酶水补至20μL。在37℃中反应60min,95℃反应5min灭活逆转录酶,-20℃保存备用。　　1.3RTPCR扩增IL

7、3RαmRNA的表达水平和FLT3ITD突变PCR采用HotStarPCR试剂盒,PCR反应体系25μL：HotstarTaqMastermix12.5μL,cDNA1.5μL,10pmol/μL上、下游引物各0.2μL,余用水补至25μL。PCR反应条件：95℃预变性15min,然后进入循环（94℃变性30s→54℃或61℃退火45s→72℃延伸60s)共30循环,72℃延伸10min。PCR所用的引物及PCR产物的预期片段为：13　　IL3Rα：　　上游：5‘CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3’　　下游

8、：5‘GTTGACGCCTGTTGGCAACG3’　　预期片段479bp。　　FLT3/ITD：　　上游：5‘GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3’　　下游：5‘TTTGACGGCAACCTGGATTG3’　　预期片段288bp,包含近膜(JM)区和激酶结构域的起始部位,覆盖文献报道的大多数ITD所在的区域。　　内