Ⅲ—02硷性磷酸酶的分离纯化及鉴定

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1、酶工程实验内容实验一殓性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。二、实验原理木实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨屮分离纯化碱性磷酸酶（简称AKP）。先用低浓度醋酸钠（低渗破模作用）制备肝匀浆。醋酸镁则冇保护和稳定AKP的作用。匀浆中加入止丁醇可使部分杂蛋口变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP在33%的丙酮或30%的乙醇中溶解，而在50%的丙酮或60%的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙

2、醇重复分离提取，可从含有AKP的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器（管）、剪刀、离心机、新华定性滤纸。原料新鲜兔肝试剂1.0.5mol/L酸镁溶液:107.25g醋酸镁溶于蒸憎水屮，定容至1000mk2.0.1mol/L醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸憾水屮，定容至1000ml3.0.01mol/L醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液：准确吸取20mL0.5mol/L醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000ml。2.Tris—HC1

3、pH8.8缓冲液：称取三超甲基氨基甲烷12.1g,用蒸傅水溶解后定容至lOOOmL,即为O.lmol/LTrls溶液。取1OOmlO.lmol/LTrls溶液，加蒸馆水约780mL,再加O.lmol/L醋酸镁溶液100ml,混匀后用1%冰醋酸调pH为8.8,用蒸憎水定容至1000mlo3.正丁醇、丙酮、95%乙醇均为分析纯试剂。四、实验操作分离纯化殓性磷酸酶的操作流程如F（以卜•操作均在0・4°C进行）取新眸兔肝剪成组织糜（CH-C）<9IF加0.01/L^M-0.01/1騎龜钠60ml.衣电动匀疑西上匀疑肝

4、匀浆体积65ml加2ftnlj^T醉屈•败腔充讹痒3-5做愴.星生溪30余讯国瑟莎希过聽▼滤^47ml加们nd冷肉炉（-101：）眾红r卑垛需心外皿转5的▼▼上淸液（弃去）沉淀［加0.5mol/L^^4ftnl.葩积为5?ml悬液加96$乙ftHSJml£3l»滿心？0皿转5的上清液6Thl沉滾（弄去）加96$乙55.8ml£65*.需屯？500转5幽上淸液（弃去）沉淀加0.Dime1/1騎龜馋-0,OlmOl筋昼钠偏1綁加9餡乙轉19,5mL全3滋・需心2000转5余钟v上洁液59mI沉沆（养去）加9餡乙醉

5、Uml£60S.滿心2500转5牛计上清液（弃去）沉淀I加0.Soiol/L驰媒畑落解，总依积35ml>99,5$内阴16.4ml£33%・需心2000转5的上诸液45ml沉滚（弃去）血肉朋（99,5$）怎加土5味需心4000转10幽上淸液1弃去）沉淀JhjpK8.STiis^3frA50nl.离心2000转5命钟上淸液（记录总体积）5衍1沉淀（弃去）（轴禧）将分离提取的殓性磷酸分装成2ml瓶，冰冻干燥保存或液体保存也可，但均置于・6(TC低温冰箱保存。应用时稀释5-7倍测其心值。实验二殓性磷酸酶的动力学鉴定

6、——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一•定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度(Vmax)°MichaelisMenten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提岀了数学方程式，即著名的米一曼方程式：V=“叫呦或心=同声晋2L—1]Km+[S]v式中即为米氏常数，为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[S]o心是酶的特征常数，测定心是研究酶的一种方法。由于用Mic

7、haeis-Menten方程屮的V与[S]作图求Km,不方便，Lineweaver-Burk将上式变形，以4/V对1/[S]作图,即：1_Kin1.1VVmax■茴Vmax作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。木实验以殓性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，殓性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在殓性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氧化钾氧化生成红色的酿衍生物，根据红色深浅口J测出酶活力高低。其反应式如下：利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性(A),按

8、Lieweaver-Burk二氏法作图，从x轴上的截距求得其心值。二、实验准备(-)仪器1.恒温水浴2.滴定管3.有塞锥瓶4.721型分光光度计(-)试剂1.0.04mol/L作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2-2H2O),用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。1.0.1mol碳酸盐缓冲液(pHlO.O):称