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1、谷氨酸脱羧酶论文：固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究【中文摘要】Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyricacid,简称GABA)是哺乳动物神经系统的一种神经递质抑制剂,对人体具有镇静安神、促进睡眠、改善免疫功能等作用,在食品和医药领域具有广泛的应用价值,由生物方法制备的GABA已被我国卫生部列为“新资源食品”。生物体内的GABA由谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,简称GAD)催化谷氨酸脱羧生成,因此GAD是GABA生物制备的关键酶。为了提高GABA生物制备方法的效率和竞争力,本文以利用固定化GAD进行GABA的
2、生物制备为目标,分别采用凝胶包埋法和金属螯合方法进行了GAD的固定化,考察了固定化条件对固定化酶性能的影响,优化了固定化条件,测定了所得固定化酶的底物亲和强度、最适催化条件和操作稳定性等关键性质,为利用固定化GAD进行GABA的生物制备创造了条件。具体研究内容如下：对聚乙烯醇(polyvinylalcohol,简称PVA)-海藻酸钠(sodiumalginate,简称SA)固定化GAD的条件进行了研究。分别考察了PVA浓度和SA浓度对凝胶颗粒直径、机械强度以及固定化后酶活力保留的影响；PVA和SA比例对固定化后酶活力保留的影响；PVA-SA与
3、GAD酶液比例对固定化酶催化活力和酶活回收率的影响；以及CaCl2浓度对固定化后GAD酶活力的影响。研究表明,当PVA浓度为9%,SA浓度为2.5%,PVA:SA(W/W)为70：30,PVA-SA:GAD(W/V)为6：1,CaCl2浓度为1%时能获得机械强度好,酶活回收率最高的固定化GAD凝胶颗粒。在上述优化的条件下,考察了固定化GAD的各项酶学性质,并与游离酶加以比较。同时,测定了固定化后GAD的表观动力学参数,评估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作稳定性。研究表明,GAD的最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适催化pH向碱性方向略
4、有改变为pH4.8；热稳定性最强的温度为45℃,比游离酶高了10℃；酸碱稳定性最好的pH为5.2,在实验设定的pH范围内,固定化GAD的稳定性大大高于游离酶；Km为13.6mmol/L;连续催化7次以后,固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右,说明PVA-SA法制备的固定化GAD凝胶颗粒操作稳定性好,具有很好的应用前景。利用亲和层析介质Ni-NTA对GAD进行了固定化,并测定了固定化后的各项酶学性质,动力学参数,考察了其操作稳定性。Ni-NTA亲和固定化GAD的最佳投料浓度为0.6mg/mL;最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适pH
5、向碱性方向略有改变为pH4.8；酸碱稳定性最强的pH为5.6,热稳定性最好的温度为35℃；Km值为34.4mmol/L;重复使用8次后,活力保持初始活力的75%。【英文摘要】GABAisanessentialneurotransmitterinhibitorofmammalwhichhasimportantmedicinalvalueandhasbeennamedas“Newresourcefood”byMinistryofHealth.GADisthekeyenzymeofsynthesisofGABAintheorganism,soitc
6、anbeusedforbiosynthesisofGABA.InordertoimprovetheefficiencyandcompetitivenessofbiosynthesisofGABA,inthiswork,weimmobilizedGADintwodifferentways,andtriedtofindthebestconditionforimmobilizationofGAD.Finally,westudiedthevariouspropertiesofimmobilizedGADincluding:optimumpHandte
7、mperatureofimmobilizedGAD,kineticconstant,operationstabilityandsoon,inordertosynthetiseGABA.Firstly,theoptimumconditionsforgelformationandGADactivitywerestudied,including:theeffectsofconcentrationofPVAandSAtodiameter,mechanicalstrength,andGADactivityretention;theeffectsofPV
8、A/SAratiotoGADactivityretention;theeffectsofPVA-SA/GADratiotoGADactivityretentiona
