污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱羧酶基因的克隆及功能研究.pdf

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1、硕女単位论文污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱幾酶基因的克隆及功能研究唐铭泽Ｉ．：＼ｉ＇——一户：、？又二〇五年六月．戈迫巧．巧去品，：‘＇：诘灘議苟；过編繁鎮讓纖觀鐵１４；．占带曲祉：杆姆嘴城：巧话石沾识扣去肚雑驗诚穩議纖鐵攀＾．Ｖ与ｆ‘＾：请；皆冲也Ｖ；：祐却靖记砖皆巧．＇寺’．分类号０７８１密缀公开ＵＤＣ硕±学位论文巧染湖泊宏基因組文库中谷氨酸脱綾酶基因的克隆及功能研究唐铭泽学科专业微生物学指导教师蒋承建教授２０１５．．论文答辩日期．０５．２８学位授予日期２０１５６３

2、０答辩委员会主節梁静娟教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，目日：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论

3、文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保在年解密后适用授权。＾跡＾密。＂＂（请在１＾上相应方框内打＞／）＾确论文作者签名Ｉ巧Ｗ：惠終日期：如指导教师签名：日期：又？／护＾皮作者联系电话：电子邮箱；污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱辕酶基因的克隆及功能研究摘要－ＡＢＡ氨基下酸（Ｇ）是哺乳动物的重要神经递质。Ｙ，具有多种保健功能谷氨酸脱簇酶在催化谷氨酸脱去簇基后，可生成ＧＡＢＡ。相对于化学合成法而言－，利用微生物技术生

4、产Ｙ氨基了酸具有不可比拟的优越性。未培养微生物中含有大量的新基因资源，而普通的分离纯化Ｗ及纯培养技术很难将其加Ｗ利用。因此，本课题探究了通过建立宏基因組文库的办法，挖掘自然界中新的谷氨酸脱簇酶基因，这在国内外谷氨酸脱幾酶的研究中鲜有报道。ＧＥＭ－３Ｚｆ＋本课题利用酸性污染的环境样品构建了ｐ为载体，（）’’拉ｃＡｅＷｃ／Ｋａｃｏ／ｚＤＨ５ａ为宿主的宏基因组文库，其中总共包含１．２万个阳性ｅｎＢａｎｋ一克隆，容量约为５０．４Ｍｂ。通过随机测序并与Ｇ数据库进行致性比对一，发现该文库中包含大量与参考序列致性较低的新基因，证明了这一方法的有效性。

5、通过活性筛选策略，最终从文库中筛选得到了两个具有明显变色反应的阳性克隆，命名为ｐＧＥＭＷｌ和ＰＧＥＭＷ２。将这两个阳性克隆中所包含的０ＲＦ与Ｇ一一ｅｎＢａｎｋ数据库进行致性比对和功能鉴定，最终获得了个编ａ妨。该基因全长约１．４化编码码谷氨酸脱簇酶的新基因，将其命名为ｇ，一４６９个５３条由氨基酸组成ｋＤａ，理论等电点为５．６１的，分子量约为多肤链。在氨基酸水平上，它与心？Ｃ化細ｉｔｏｎｚ／ｗ属编码的谷氨酸脱簇酶％的一具有９９致性，但该基因来自于全基因组注释，并没有进行功能鉴定。Ｉ将ｇｏ奶基因表达的重组蛋白经镇柱纯化后，对其酶学性质进行测定，

6、‘２＋２＋２＋２＋２＋发现其最适湿度为３７Ｃ，最适ｐＨ值为４．７，Ｓｒ，Ｃｏ，Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｇ２＋３３＋２＋２＋和Ｚｎ对酶促反应有明显的激活作用，Ａ１＼Ｆｅ、Ｍｉｉ和Ｃｕ对酶促反应。ＥＤＴＡ有明显的抑制作用对酶活有明显的抑制作用，说明该酶对金属离子二－具有依赖性．６１９ｍ／ｍＬ，ｋ／１９．４８３ｍＬ／ｍｓ。。纯酶的值为０ｇｃａｔ＆ｎ（ｇ）与其他来源的谷氨酸脱簇酶相比较，该酶的性质参数处于中等水平。本研究建立了一整套利用宏基因组文库技术克隆得到新的谷氨酸脱綾酶基因的方法一，对于后续研究具有定的借鉴意义。关键词：宏基因组文库技术谷氨酸脱拨

7、酶大肠巧菌表达系统功能鉴定活性筛选ＩＩＧＥＮＥＣＬＯＮＩＮＧＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＡ以ＧＬＵＴＡＭＩＣＡＣＩＤＤＥＣＡＲＢＯＸＹＬＡＳＥ＂妨ＦＲＯＭｇＣＯＮＴＡＭＩＮＡＴＥＤＬＡＫＥＭＥＴＡＧＥＮＯＭＥＡＢＳＴＲＡＣＴＧａｍｍａａｍｉｎｏａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ｉｓ泣ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｉｎｍａｍｍａｌｓ，ａｎｄｉｔｈａｓｔｈｅ扣ｎｃｔｉｏ打ｏｆｉｎ